PERBINCANGAN

             Sebanyak 50 slaid dari kes kanser kolon yang telah saya kaji sepanjang kajian yang dilakukan.Dari 50 slaid tadi ,sebanyak 25 slaid termasuk satu slaid  kontrol positif Ki-67  telah digunakan untuk menguji keberkesanan terhadap teknik pemulihan antigen menggunakan ketuhar gelombang mikro dalam mengesan antigen Ki-67 .Manakala selebihnya ,24 slaid dari blok yang sama digunakan diatas, bersama satu lagi slaid kontrol positif  Ki-67 digunakan tetapi tanpa menggunakan apa-apa teknik pemulihan antigen.

Hasil daripada kajian , saya mendapati bahawa dengan teknik pemulihan antigen menggunakan teknik ketuhar gelimbang mikro terhadap antigen Ki-67 adalah sangat sesuai dan perlu digunakan setiap kali ujian Immunohistokimia terhadap antigen Ki-67 diminta di Makmal Patologi . Kenyataan saya ini telah disokong oleh  N.A.Byron dalam (Journal of Cellular Pathology 1997 Vol.2) mengenai ‘antigen retrieval on paraffin-embedded tissue fixed with various fixatives’ . Dari kajian beliau menggunakan antibodi monoklonal MIB-1 yang bertindak dengan nuklear antigen Ki-67. Antigen ini yang berkaitan dengan proliferasi sel dan boleh dijumpai sama sekali dalam kitar sel tetapi tidak hadir dalam fasa berehat ‘resting’ sel . Dari kertas data itu didapati hanya dengan penggunaan teknik pemulihan secara pemanasan sahaja yang memberikan keputusan yang positif selepas difiksatif dalam formal salin ,Bouin’s atau fiksatif Zenker.Dalam projek tersebut tiada keputusan yang positif didapati samada tanpa menggunakan teknik pemulihan antigen atau pencernaan enzim.

Dengan menggunakan teknik pemulihan antigen menggunakan ketuhar gelombang mikro menunjukkan jumlah kes yang semakin tinggi apabila menuruni skor slaid iaitu 4 kes pada skor 1+, 9 kes pada skor 2+ dan 11 kes pada skor 3+ .Berbeza pula dengan keputusan tanpa menggunakan apa-apa teknik pemulihan antigen yang menunjukkan kes semakin rendah apabila menuruni skor pada slaid iaitu bagi skor 1+ sebanyak 15 kes ,skor 2+ sebanyak 7 kes dan bagi skor 3+ pula sebanyak 2 kes.Ini menunjukkan bahawa dengan teknik pemulihan antigen lebih banyak reaktif nuklei yang positif dapat dikesan dan menambah skor yang tinggi pada slaid yang menjalankan ujian terhadap antigen Ki-67.

Manakala peratus bagi teknik pemulihan antigen menunjukkan peningkatan peratus yang seimbang dimana lebih kurang 16.7 % adalah skor bagi 1+, lebih 37.5% adalah skor bagi 2+ dan 45.8 % adalah skor bagi 3+  berbanding dengan peratus bagi yang tidak menggunakan apa-apa teknik pemulihan antigen yang menunjukkan peratus yang tinggi bagi skor 1+ iaitu 62.5% ,bagi skor 2+ iaitu 29.2% dan skor bagi 3+ iaitu sebanyak 8.3%.

Untuk mendapat perbandingan yang lebih mendalam terhadap kajian mengenai antigen Ki-67 ,seterusnya dalam kajian ini saya mendapatkan gred histologi bagi spesimen yang diambil yang telah direkod dalam buku Master Rekod Makmal Patologi.Dari perbandingan itu saya dapati dengan teknik pemulihan antigen antara skor slaid dengan gred histologi tidak menunjukkan hubungan lansung yang jelas (rujuk pada bahagian Penggredan Slaid Ki-67 .Bagi gred 1 terdapat 10 kes , manakala gred 2 pula sebanyak 12 kes dan gred 3 hanya sebanyak 2 kes sahaja.Ini mungkin disebabkan oleh kaedah skor yang menggunakan peratus terlampau yang rendah.Adalah digalakkan pada masa hadapan supaya skor bagi slaid bagi mana-mana kajian yang berkenaan dengan proliferasi nuklear sel antigen supaya meningkatkan lagi peratus bagi tiap-tiap skor iaitu dari 1+ ,2+ dan 3+ .

Banyak faktor yang mempengaruhi keputusan diatas , dimana keputusan yang lebih tepat boleh diperolehi berbanding dengan kajian yang saya lakukan.Kemungkinan yang besar kegagalan dalam mempamerkan intensiti pewarnaan adalah disebabkan oleh kesilapan teknikal semasa melakukan ujian.Kesilapan dan juga kecuaian dalam melakukan boleh menyebabkan keputusan positif palsu atau negatif palsu.Tisu yang dibiarkan kering semasa meletakkan antibodi ke atas tisu juga boleh menyebabkan pewarnaan kurang memuaskan dan boleh menyebabkan berlakunya keputusan negatif palsu.Walaupun dalam kajian ini, saya menggunakan ‘Disposable Imunostaining Chamber’ yang boleh mengelakkan tisu daripada kering namun masalah baru pula timbul jika terdapat gelembung udara pada slaid yang dikapit bersama dengan ‘cover plate’ yang juga boleh memberikan keputusan negatif palsu.

Antara faktor yang paling penting terlibat dalam menghasilkan keputusan yang terbaik ialah faktor pencairan antibodi dan reagen .Pencairan yang terlalu rendah menyebabkan penggabungan di antara  antibodi dan antigen yang tidak mencukupi.Ini menyebabkan intensiti pewarnaan yang kurang memuaskan .Manakala pencairan antibodi yang terlalu pekat dari yang disyorkan menyebabkan pembaziran antibodi.

Selain itu ,masa pengeraman juga penting ,samada eraman untuk antibodi atau pengeraman dalam proses pemulihan antigen.Masa pengeraman yang tidak mencukupi menyebabkan antibodi mudah tercabut semasa proses pembasuhan dan juga menyebabkan pendedahan antigen yang tidak mencukupi.Masa pengeraman yang terlalu lama pula dalam proses pemulihan antigen menyebabkan kesan yang sebaliknya.Ia bukan sahaja mendedahkan lapisan protien antigen tetapi juga menyebabkan kerosakan pada antigen dan secara tidak lansung menyebabkan keputusan negatif palsu.

Selain itu, teknik pemulihan antigen yang digunakan mungkin menpengaruhi kepekatan antibodi dan antigen yang terdapat pada hirisan tisu .Misalnya suhu yang terlalu tinggi menyebabkan larutan antibodi atau antigen yang digunakan musnah dengan sendirinya (Gray N.,1998) .Malah fiksasi yang lebih dan hirisan yang berkadar lemak yang tinggi turut menpengaruhi pewarnaan yang memungkinkan hirisan tisu tertanggal dari slaid.

Manakala teknik pewarnaan yang berkemungkinan besar mengpengaruhi keputusan ini adalah semasa pengaplikasian antibodi-antibodi berjambatan .Antibodi sekunder yang berbiotin memainkan peranan yang penting sebagai penyambung antara antibodi primer dengan antibodi bersterptavidin yang berlabel enzim dalam jambatan antibodi tersebut (DAKO Sheet-Biotinylated Anti Mouse immunoglobulin).Oleh itu ,sekiranya antibodi sekunder tersebut tidak dimasukkan ,maka antibodi primer walaupun bercantum dengan antigen ,percantuman atau kompleks antibodi-antigen tersebut tidak dapat dikesan dan diperhatikan melalui perubahan warna coklat pada akhir produk.

Sememangnya teknik pemulihan antigen dan teknologi kompleks avidin-biotin digunakan secara meluas dalam Immunositokimia . Walaubagaimanapun, pemulihan antigen selalu memerlukan pengesanan imuno yang optima dalam fiksatif formalin tisu pembenaman paraffin dan adalah terlebih dahulu memerlukan penggunaan sesetengah primer antibodi yang berkesan. Akan tetapi ,pemulihan antigen secara khususnya meningkatkan kebolehan pengikatan avidin pada sesetengah sel dalam sesetengah tisu sehingga menyebabkan pewarnaan positif palsu berlaku.Pewarnaan ini adalah disebabkan untuk pengikatan avidin dan boleh hadir dalam tisu yang pelbagai.Ini mungkin terjadi dalam tisu yang difiksatif dalam formaldehid tetapi tidak pada tisu yang difiksatif dalam Carnoys atau larutan Clarkes.

Untuk menghalang pewarnaan sel ‘mast’ yang bergranul dalam immunositokimia adalah dengan menggunakan larutan avidin yang pH beralkali atau kekuatan ionik yang tinggi.Banyak reagen yang boleh digunakan untuk mengurangkan perlekatan yang tidak spesifik  yang telah disyorkan termasuklah serum kambing,serum kuda,bovine serum albumin (BSA) ,gelatine dan lysine.

Tidak dapat dinafikan lagi bahawa kesemua teknik pemulihan antigen  akan meningkatkan lagi pengikatan avidin seterusnya antigen-antigen yang terpilih.Penggunaan pemulihan antigen secara enzimatik menghasilkan keputusan yang kurang memuaskan ,manakala dengan teknik periuk tekanan pula secara kontra menghasilkan keputusan yang paling baik dan teknik secara ketuhar gelombang mikro menghasilkan keputusan yang kurang sedikit dari teknik periuk tekanan .Sungguhpun begitu , trypsin dan pepsin menghasilkan sedikit pewarnaan pada masa yang ditetapkan (standard time).

Penggunaan larutan pemampan pemulihan antigen penyelesaian haba (Heat Mediated Antigen Retrieval -HMAR) yang berbeza menunjukkan keputusan berbeza tetapi secara umumnya pewarnaan meningkat dengan peningkatan pH. Dengan penggunaan larutan pemampan natrium sitrat pH 3 menghasilkan pewarnaan yang sedikit ,manakala pH 5.0 menghasilkan pewarnaan yang sederhana dan pH 6.5 menghasilkan pewarnaan yang baik. Manakala Natrium Hikroksida-Sitrik Asid pH 6.0 menghasilkan keputusan pewarnaan yang sama dengan Larutan pemampan Natrium Sitrat  pH 6.5.Oleh itu,bagi kajian ini, menggunakan larutan pemampan Natrium Sitrat berpH 6.0.

Penggunaan larutan pemampan yang lain boleh digunakan tetapi memberikan keputusan yang kurang memuaskan seperti contohnya penggunaan Natrium Hidroksida-EDTA pH 4.0 menghasilkan pewarnaan yang sedikit tetapi sel darah merah amat lemah diwarnakan ,pH 6.0 menghasilkan pewarnaan yang sederhana hingga baik ( sama dengan larutan pemampan Natrium Sitrat) , pH 7.0 menghasilkan pewarnaan yang baik dan mula menyebabkan tisu tertanggal dari slaid dan lebih-lebih lagi pH 8.5. Kesemua pewarnaan sel darah merah akan dapat dibuangkan dengan mengeramkan hirisan tisu kedalam akues 2.75% H₂O₂  tetapi ianya tidak diblok oleh avidin-biotin. (P.Clark, D.A.Agbamu, N.Y.Haboubi ,Increased avidin binding due to antigen retrieval: strategies for indentifying and reducing this widespread phenomenon , Journal of Cellular Pathology 1998 Vol. 3 no. 3,105-112 ).

Dari keseluruhan kajian saya ini, bolehlah rumuskan bahawa penggunaan teknik ketuhar gelombang mikro adalah kaedah yang paling sesuai yang berkesan dan berhasil untuk mengesan antigen Ki-67 pada permukaan tisu .Namun begitu ,semua faktor-faktor dan ciri-ciri yang menpengaruhi pewarnaan perlu dipatuhi untuk mendapatkan intensiti pewarnaan yang baik.