UNIVERSITY OF CALIFORNIA. IRVINE
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BERKELEY * DAVIS * IRVINE * LOS
ANGELES * RIVERSIDE * SAN FRANCISCO * SANTA BARBARA * SANTA CRUZ
LOS
EFECTOS INMUNOMODULATORIOS DE HANSI IN VITRO E IN VIVO.
Darryl M. See 1, Jeremíah G. Tüles 1, Juan J. Hirschmann 2, Cesar E.
Bertacchini 2,
Departamento de Medicina
Facultad de Medicina, Universidad de California, Irvine
Orange, California 92558
Se
han llevado a cabo investigaciones sobre los efectos inmunoestimulatorios in
vitro e in vivo de HANSI. Para
esto, se aislaron las células sanguíneas periféricas mononucleares (PBMC) de
los controles normales y, a pacientes con el Síndrome de Fatiga Crónica (SFC)
o con el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) se les incubó durante
24 hs una dilución de 1:10 de HANSI o un 5% de placebo de etanol.
Es dable destacar que HANSI aumentó significativamente la actividad de
la célula Natural Killer (NK) versus las células K562 en un ensayo estándar
Cr 51 de 4h que se comparó a un placebo para las PBMC en controles normales
(p<.05) o en pacientes con el SFC (p<.01) o SIDA (p<.01). Se suninistró
un 5% de placebo de etanol o de HANSI a un grupo de ratas adolescentes CD-1 en
una dosis de 0,35 cc en forma diaria durante 28 días.
Ninguna de los ratas manifestó evidencias de toxicidad macro o microscópica
(ya sea en el cerebro, en el riñón, en el hígado, en el páncreas o en el
corazón). La función esplénica
NK versus las células en diana YAC-1 fue mucho mayor en aquellas ratas que se
habían tratado con HANSI (media 103 +/- 10,9 unidades líticas [LU]; p<.05)
que las comparadas al placebo (media 81 +/- 7.4 LU).
A un grupo de ratas se las trató durante 21, 14, 7 y 0 días con HANSI o
placebo y después se las expuso a unidades formadoras de plaquetas 1 x 10 4
(ufp) de una línea diabetogénica de virus coxsackie B4 (E2).
El
Síndrome de Fatiga Crónica (SFC) es una alteración de etiología desconocida
que se caracteriza por síntomas que perduran en forma permanente, una fatiga
aguda y los defectos cognoscitivos (1). En
la actualidad el diagnóstico se basa en los criterios clínicos establecidos
por el Centro para el Control y la Prevención de las Enfermedades.
Varias hipótesis se han propuesto para explicar la causa de la
enfermedad como por ejemplo la disfunción psiquiátrica (2), los disturbios de
las glándulas del hipotálamo, las pituitarias y suprarenales (3), las
irregularidades inmunológicas (4) y/o las infecciones vírales (5).
Todavía no se ha podido encontrar un tratamiento eficaz para esta
enfermedad.
El
Síndrome de Inmunodeficíencia Adquirida (SIDA) es la última etapa de una
enfermedad causada por una infección crónica del Virus de Inmunodeficiencia
Humano (HIV). La mayoría de los
pacientes afectados desarrollan a lo largo de los años una deficiencia
progresiva del sistema inmune que finalmente termina en muertes causadas por uno
o mas cánceres o por infecciones oportunistas.
Se
ha observado en pacientes con el Síndrome de Fatiga Crónica (SFC) a veces que
la función de la célula Natural Killer (NK) ha disminuido y algunos estudios
han demostrado un efecto clínico beneficioso de los moduladores inmunes (6,7).
Los individuos infectados con HIV padecen una función NK defectuosa que,
en forma progresiva, se degenera a medida que la enfermedad avanza (8).
Todavía no se ha observado en estos pacientes un efecto clínico
positivo e intensfflcador de la inmunidad, aunque la terapia con Interleuquina 2
(IL-2) resultó ser beneficiosa en una investigación que se ha llevado a cabo
(9). Por lo tanto, el SFC y el IUV son similares en el sentido en
que ambos se caracterizan por dar como resultado la disminución de la función
NK. Para el caso del HIV, el rol de los virus está probado y para el caso del
SFC es un supuesto, y no hay cura. Por
lo tanto, no es sorprendente que muchos pacientes recurran a otras modalidades
de tratamientos como por ejemplo las preparaciones homeopáticas que se
encuentran a un lado de la corriente principal de la medicina Occidental.
Los
preparados homeopáticos se han usado para tratar una amplia gama de
enfermedades desde fines del siglo XVIII (10).
Estos medicamentos homeopáticos se realizan en base a preparados
vegetales, animales o minerales y se diluyen con líquidos hasta concentraciones
micromolares. La eficacia de las fórmulas
homeopáticas nunca se ha comprobado en forma científica, aunque hay dos
meta-análisis que dieron resultados positivos en mas del 65% de las pruebas clínicas
(11, 12). Sin embargo, hay que
tener en cuenta dos factores: Por un lado, probablemente, a la mayoría de estas
pruebas no se las controló correctamente y, por el otro lado, no se debe haber
incluido la cantidad necesaria de pacientes.
Hasta el día de hoy, se desconoce cuál es el mecanismo de acción de
los productos homeopáticos.
HANSI
y otras preparaciones homeopáticas postulan como resultado mas válido al
efecto intensificador de la inmunidad. HANSI
contiene 5% de alcohol y concentraciones micromolares de Cactus Grandiflora,
Aloe Socotrina, Abies Nigra, Arnica, Lachesis, Carbonato de Calcio y Licopodium.
Los informes históricos sugieren como resultado una mejor sobrevivencia y una
calidad de vida superior en algunos pacientes infectados con HIV.
La preparación ha resultado ser no tóxica en el uso adjutor y medido
para pacientes con cánceres incurables. En
este estudio, se realizaron las siguientes observaciones:
*
HANSI estimuló en forma significativa la actividad in vitro de la Célula
Natural Killer, de las células sanguíneas periféricas mononucleares (PBMC) de
los controles normales y de los pacientes con SFC o SIDA.
*
Cuando se la administró en altas dosis a las ratas resultó ser no tóxica.
*
La preparación aumentó en forma significativa la función esplénica NK en
ratas.
Preparación
médica:
Se
combinaron extractos de Cactus Grandiflora, Aloe Socotrina, Abíes Nigra, Árnica,
Lachesis y Licopodium con Carbonato de Calcio de acuerdo con los métodos y las
especificaciones de la Farmacopea Homeopática de Estados Unidos .
A cada extracto se lo diluyó en 5% de etanol y agua esterilizada y se lo
combinó con los demás componentes y a la mezcla final se la potenció por
medio de centrifugado. El análisis de la mezcla final por medio de una
espectrofotometría reveló que el contenido solo está formado por agua y
etanol. Este resultado se condice
con la práctica homeopática estándar que consiste en diluir los componentes
iniciales a tal punto que posteriormente no pueden detectarse a través de los métodos
comunes.
Los
estudios in-vitro
El
efecto de HANSI sobre la función NK:
La
preparación de las PBMC:
Se
extrajo sangre anticoagulada de 20 individuos normales elegidos del personal del
Centro Médico de Irvine, de la Universidad de California entre las 12:00 hs y
las 14:00 hs y de otros 20 pacientes agrupados de acuerdo a la edad y al sexo
que padecían el SFC (como lo definió la CDC en 1988) o SIDA (CD4 cantidad
<200). A los pacientes con SFC o
SIDA se les permitió tomar medicamentos (con o sin receta) pero no se les
permitió el uso de agentes con efectos inmunomodulatorios ya sean demostrados o
supuestos como lo son los corticoides, los factores que estimulan colonias, la
interleuquina-2, los interferones o la quimioterapia para el cáncer.
A las PBMC se las separó de las otras células por medio de la
centrifugación estándar por gradiente de densidad Ficoll-Hypaque (13).
A las células PBMC se las mantuvo en completo RPMI con suero bovino
fetal (SBF) al 10% inactivado por calor. Inmediatamente
después se las testeó.
Ensayo
de la función Natural Killer:
La
actividad celular NK fue determinada por una variación de un ensayo estándar
de citotoxicidad.
Las
células K562, mantenidas en completo RPMI con 10% de SBF (inactivado por calor)
fueron marcadas como células target. Fueron
clasificadas con 20 uC 51 Cr (ICN, Costa Mesa, CA) durante una hora a 37°C (5%
CO2), se lavaron 4 veces con medio y se agregó a una concentración de 5 x l03
células/well en 96-well estructuras de microtítulo U-bottom.
Las células electoras (PBMC) se agregaron por triplicado a las wells en
un radio target efector de 40:1, 20:1, 10:1 y 5:1 con HANSI en una dilución
total de 1: 10 o con etanol para darle una concentración final de 0,5%.
En alguno de los casos las células efectoras habían sido pre-incubadas
con un aditivo de 24 hs. Las control wells contenían células target y
solamente, ya sea HANSI o etanol para la determinación de la lisis espontánea,
o el 3% de Triton X-100 para poder evaluar la lisis total.
Después de una incubación de 4 horas a 37°C (5% C02), las células
fueron centrifugadas durante 10 minutos a 1.500 x g, y se extrajo flotante 100
ul del supenatante y se mezcló con 2,5 ml del cocktail del centelleo (Fisher
Scientfflc, Tustin,CA). La
radioactividad se determinó por el contador de centelleo líquido (Beckman
LS-100) y la actividad citotóxica se calculó en base a las unidades líticas
(LU) por medio de un programa de software que H. Pross nos proporcionó (15).
A una unidad lítica se la define como el número de células efectoras
requeridas para lograr una lisis específica del 20% de 5 x 103 targets.
Las LU fueron calculadas cada 107 células efectoras.
La
actividad y la toxicidad antiviral in vitro:
La
actividad del virus se determinó en las células monocapas Monkey Kidney (MK)
en presencia del 5% de etanol o diluyente L15 de Liebovitz's (controles) o
diluciones de HANSI en sucesivas concentraciones aumentadas 10 veces con el
virus cocksackie B4 (CVB4) cepa E2 a un inóculo de 1 unidad formadora de placas
(PFU) por célula. La toxicidad de
la célula se determinó marcando la formación morfológica y monoestrática de
las células MK que crecieron en presencia del HANSI sin diluir (la concentración
final del 20%).
La
prueba in vivo:
Animales:
Se usaron ratas adolescentes CD-1 de 4 semanas de vida de la Granja de Charles
River (Wilmigton, MA).
Virus:
CVB4 cepa E2 se propagó y se mantuvo de acuerdo a la explicación descripta
(16).
Métodos
experimentales:
Estudio
de la toxicidad:
Se
administró placebo (etanol 5%) o HANSI a grupos de 10 ratas adolescentes CD-1.
Se les inyectó diariamente en forma subcutánea 0,35 cc de placebo o la
preparación activa durante 28 días consecutivos.
Se las observó diariamente para ver si se habían producido evidencias
de alta toxicidad (ataxia, letargo o irregularidad respiratoria). Después de 28 días, las secciones de los cerebros, riñones,
hígados, páncreas y corazones se introdujeron en formalina, se embebieron en
parafina, se cortaron con un micrótomo y se fijaron sobre la platina con
hematoxilina y eosina para examinarlos con el microscopio y, así observar los
cambios histopatológicos.
El
efecto in vivo de HANSI sobre la estimulación de la función esplénica NK:
A
las ratas CD-1 se les suministró diariamente durante 28 días consecutivos en
forma subcutánea 0,35 cc de HANSI o 5% de etanol (placebo). Se extrajeron los
bazos y se los presionó a través de una malla metálica de acero inoxidable y
se los mantuvo en completo RPMI. Se
agregó 0,83% de cloridio amonium durante 3 minutos para disolver los
eritrocitos. Las células
mononucleares se separaron de las demás poblaciones de células por medío de
la centrifugación Ficoll-Hypaque, mantenidas en completo RPMI y se las usó
inmediatamente después como células efectoras.
Las células YAC-1 sensibles a las NK (Colección del Tipo de Cultura
Norteamericana) se mantuvieron en RPMI completo y se las usó como células
target. Se las identificó como 50
uC 51 Cr durante una hora y media a 37° (5% CO2), se las lavó 4 veces con
medio, y se agregaron a una concentración de 1 x 104 células/well.
Las células efectoras esplénicas se agregaron por triplicado a las well
en un radio target efector de 40:1, 20:1, 10:1 y 5:1.
La radioactividad en 100 ul de supenatente se midió como se describió
anteriormente y se calculó en LU.
El efecto antiviral in vivo:
Se
les administró a las ratas 0,35 cc de placebo (etanol 5%) o HANSI en forma
subcutánea diariamente durante 21,14 ó 7 días consecutivos antes de la
exposición con el virus, o comenzando el día de la incubación del virus.
A los animales se los expuso en forma intraperitoneal con unidades
formadoras de placas (ufp) 1 x 104 CVB4 cepa E2. El tratamiento continuó de la
misma forma. Tres días después de
la inoculación del virus se obtuvieron muestras de los páncreas.
El título del virus en el tejido homogeneizado se determinó por medio
de un ensayo de placas. Las ratas
de control solo recibieron a HANSI pero sin exposición viral para poder evaluar
la toxicidad. Las restantes solo
recibieron el 5% de etanol y sirvieron como controles sin infección.
Ensayo
de NK in vitro:
La
función promedio NK fue de 103,7 +/- 22,1 LU en 20 controles normales. La función NK se redujo considerablemente en 20 pacientes
con el SFC (47,3 +/- 16,2:P<.01) y en 20 pacientes con SIDA (8,0 +/- 3,8;
P<.001). Un aumento significativo de la función NK para los tres grupos se
observó cuando las PBMC preincubadas durante 24 horas con HANSI se usaron como
efectores comparados con los efectores sin ningún aditivo (Cuadro l).
El efecto fue mayor para los pacientes con SFC o SIDA (P<.01 para los
dos casos). El agregado de etanol o
HANSI sin la preincubación no aumentó la función NK en ninguno de los grupos.
El
efecto y la toxicidad antiviral in vitro:
La
respuesta del CVB4 cepa E2 no se inhibió ante las concentraciones de HANSI.
No se observó ningún tipo de toxicidad en la célula MK (redondeo de la
célula y/o irregularidad monoestrática) después de la incubación con HANSI
sin diluir.
La
toxicidad in vivo:
No
hubo signos de toxicidad densa ni microscópica en ninguno de los tejidos
examinados.
Estimulación
in vivo de la función esplénica NK:
La
función esplénica NK versus las target YAC-1 fue significativamente mayor en
las ratas tratadas con HANSI durante 28 días (promedio 103 +/- 10,9 LU;
P<.05) que las comparadas con el placebo (promedio 81 +/- 7,4 LU).
El
efecto antiviral in vivo:
Los
títulos del virus en el páncreas se redujeron significativamente en el grupo
HANSI que se trató durante 21 días antes de la exposición al virus (promedio
<log 10> 3,14 +/- 0,79 ufp/mg; P<.05) en comparación con los animales
infectados tratados con un placebo similar (4,29 +/- 0,90 ufp/mg; Cuadro l).
El tratamiento con HANSI durante 14 días o inferior a los 14 días antes
de la exposición del virus no provocó una reducción en el título del virus
en el páncreas cuando se lo comparó con las ratas que se habían tratado con
un placebo similar.
Los
resultados de varios informes históricos y los estudios que se han llevado a
cabo sin el suficiente control sugieren que los productos homeopáticos pueden
ser beneficiosos en situaciones clínicas como la diarrea, rinitis alérgica e
influenza (17,18,19). La mejor
prueba de eficacia ha sido la que se ha efectuado para el asma dado que las tres
pruebas controladas por placebo en las que se usaron preparaciones homeopáticas
con alergenos dieron buenos resultados (20,11,18).
Los
productos homeopáticos contienen sustancias que se han diluido a tal punto que
ni siquiera se las puede detectar a través de la espectrometría.
Tampoco se ha podido descubrir cuáles son los mecanismos de acción de
estos productos. Sin embargo, este
hecho no debería desalentar a las investigaciones que se inicien en el futuro
sobre la homeopatía y sobre otras terapias como por ejemplo la inmunoterapia de
la alergia que actúa a través de procesos que hasta hoy son completamente
desconocidos. Las investigaciones
sobre homeopatía debería llevarse a cabo empleando métodos aleatorios
controlados por placebos y teniendo en cuenta los objetivos finales.
De esta forma se debería arribar a estudios positivos.
Los
resultados sobre HANSI, que consiste en una preparación homeopática en base a
una mezcla de productos vegetales, animales y minerales, sugieren que aumenta la
función NK in vitro y en ratas. Los
resultados positivos obtenidos en el estudio in vitro son realmente notables
dado que, con anterioridad, no se había establecido ninguna evidencia de
actividad in vitro de ningún producto homeopático.
Las investigaciones in vitro deberían ayudar a estudiar productos
promisorios antes de efectuar las pruebas clínicas pertinentes.
Los resultados también sugieren que es probable que se requieran
realizar modificaciones en los ensayos in vitro que estén bien establecidos,
posiblemente debido a que los mecanismos de acción de los productos homeopáticos
son diferentes a los de los medicamentos alopáticos.
Por ejemplo, en este estudio, un ensayo estándar sobre la función NK
que libera Cr 51 de 4 h no ha demostrado que HANSI sea eficaz.
En efecto, se necesitó llevar a cabo la preincubación con células
efectoras. Hasta el presente se
desconoce la razón de este descubrimiento y, por esto, es necesario que se siga
investigando sobre el tema.
HANSI
demostró ser eficaz porque logró estimular la función NK in vitro en
pacientes afectados por el SFC y SIDA que son alteraciones que se originan
debido a que la inmunídad celular es defectuosa.
Por lo tanto, es realmente necesario realizar pruebas para poder
establecer la eficacia clínica en las enfermedades inmunológicas.
La elaboración del mecanismo de la estimulación NK también está
garantizada Finalmente, esta
investigación demostró que la estimulación NK pudo lograrse in vivo (usando
ratas) y que el aumento de inmunidad dio como resultado establecer una barrera
de protección al virus NK, CVB4. Sín embargo, el uso potencial como agente
antiviral se dificulta por el hecho de que se requiere un período de
tratamiento anterior (21 días). Por
lo tanto, HANSI podría llegar a ser mas útil como agente profiláctico que
como tratamiento para contrarrestar las acciones de una infección viral aguda.
Las excepciones serían persistentes: los virus sensibles a la célula NK
como lo son la hepatitis B y el HIV.
Cuadro
1:
Efecto
de HANSI sobre la función NK para las PBMC de los controles normales ó
pacientes con SFC ó SIDA.
|
DIA DE INICIO |
HANSI |
PLACEBO |
P |
|
0 |
4,36 +/- 1,01 |
4,17 +/- 0,96 |
NS |
|
-7 |
4,11 +/- 0,85 |
4,33 +/- 0,35 |
NS |
|
-14 |
3,95 +/- 0,99 |
4,21 +/- 0,79 |
NS |
|
-21 |
3,14 +/- 0,79* |
4,29 +/- 0,90 |
< 0.5 |
Los
resultados representan promedios para grupo de 10 ratas.
A
los animales se los trató con 0,35 cc de placebo o con HANSI.
Se les inyectó en forma subcutánea desde el comienzo hasta el día en
que se las sacrificó.
*
A los títulos <2 se les asignó un valor de 1 para poder determinar el
promedio.
NS
= No es signficativo.
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