INCONVENIENTES DEL USO DE VECTORES VIRALES

La capacidad de la cápside para llevar DNA es limitada y esto supone una barrera importante, ya que hay que escoger fragmentos pequeños de DNA, a los cuales hay que añadir otras cosas que ocupan espacio, como marcadores para poder localizarlos después, la partícula "psi", la transcriptasa inversa etc. Por ello, suele usarse el cDNA (DNA sin intrones, obtenido por tratamiento con transcriptasa inversa a partir de mRNA).

Además, la inserción de genomas víricos puede en sí misma provocar procesos neoplásicos si se usan virus potencialmente oncogénicos.

TIPOS DE VECTORES VIRALES USADOS EN TERAPIA GÉNICA CONTRA EL CÁNCER

Básicamente, los vectores virales más usados en terapia génica son retrovirus y adenovirus:

Retrovirus

Son los que primeramente y más ampliamente han sido utilizados.

Usados en la técnica ex vivo, pueden portar hasta 9 kb y sólo son aplicables en células que están proliferando activamente, lo que representa un problema para el tratamiento contra el cáncer porque no consiguen abarcar toda la masa tumoral; integran el DNA terapéutico (duración indefinida) y existe riesgo de inducir mutaciones por inserción. Se adaptan fácilmente a transportar insertos de genes humanos.

Su genoma se constituye por una cadena simple de RNA (ssRNA) y se replican mediante la formación de una cadena doble de DNA (dsDNA) como intermediario (provirus). Durante su ciclo vital, es imprescindible la inserción de la doble cadena de DNA, dirigida por las secuencias LTR del virus, en el genoma huésped. Estas secuencias contienen el promotor y otros elementos génicos necesarios para la traducción de los tres principales genes virales (gag, pol y env ).Gag codifica para las proteínas del core, Pol codifica la transcriptasa inversa y env codifica las glicoproteínas de la cubierta viral. Además hacia el extremo 3’ de la secuencia LTR, entre ésta y los genes estructurales, existe una secuencia esencial para el empaquetamiento de la partícula viral. Si la secuencia se altera o se deleciona, el RNA genómico no se integra en la partícula viral.

Con fines de terapia génica se construyen dos tipos de retrovirus: delecionado o modificado. Como carecen de la secuencia esencial del extremo 3', no ocurre el empaquetamiento del RNA genómico viral, ya que se han eliminado del virus las secuencias gag, pol y env, codificadoras de nucleoproteínas. Luego, al genoma se le incorpora una nueva secuencia génica conteniendo el gen terapéutico. Así, el vector deficiente en replicación es amplificado en las células empaquetadoras (packaging cells), que sí contienen en su genoma las secuencias gag, pol y env. El vector contentiendo el gen terapéutico infecta a la célula diana utilizando receptores específicos y, una vez en el citoplasma, la transcriptasa inversa (transportada por el vector) convierte el vector RNA en DNA proviral, que se integra al azar en el genoma huésped para que su producto terapéutico sea expresado. Normalmente no elimina las células que infecta.

La inyección directa de retrovirus sobre tumores cerebrales de ciertos pacientes ha sido practicada, resultando en una detención del crecimiento de la masa tumoral acompañada de una mejora significativa de los síntomas, aunque no se ha observado regresión del tumor.

El virus de la leucemia murina de Moloney es uno de los más utilizados para la creación de vectores.

VENTAJAS

• Se integra en el genoma del huésped.

DESVENTAJAS

• La integración es al azar y puede provocar mutagénesis insercional.
• Requiere células en división activa.
• Las células de empaquetamiento disponibles producen bajos títulos virales.
• Los virus infectantes son difíciles de concentrar y de almacenar por períodos prolongados de tiempo.
• Eventos recombinacionales pueden ocurrir entre el vector viral y virus endógenos.
• Admiten poco DNA foráneo. Aproximadamente 7Kb (13,14,15 y 16).

El virus HIV es un ejemplo de Retrovirus

Adenovirus

Su genoma es de aproximadamente 36 Kb, presenta genes que codifican para proteínas de síntesis temprana y tardía.

El DNA es de doble cadena (dsDNA), pueden infectar un amplio rango de líneas celulares independientemente de si están en división o no (por ejemplo, células neuronales).

Son virus poco infectantes por lo que las enfermedades que ocasionan son benignas.

Sus ventajas han determinado que se hayan desarrollado mucho como sistema de vector viral. Su uso ha sido aprobado por la FDA (Food and Drug Administration USA). 

E1, E2 A, E2 B, E3 y E4 son genes que codifican para distintas proteínas virales. Estos genes son eliminados en distintas combinaciones para insertar el gen terapéutico.

Usados en la técnica in vivo. No integran el DNA terapéutico (se replica como un episoma), por ello su duración limitada (semanas-meses), aunque no existe riesgo de mutación. Pueden inducir respuesta inmune en el paciente. Los vectores adenovirales son ampliados más adelante en este trabajo.

VENTAJAS

• Admiten hasta casi 36 Kb de DNA exógeno ( ya que se le puede delecionar casi todo el material génico involucrado en la replicación viral).
• Se obtienen títulos elevados de adenovirus recombinantes.
• Pueden infectar también a células en no división.

DESVENTAJAS

• Contienen genes que se encuentran involucrados en procesos de malignización in vitro.
• Desencadenan efectos secundarios a la infección como son ambas respuestas inmunes, lo que determina que no pueda ocurrir una segunda infección.
• No se integran en el genoma del huésped.
• La respuesta es transitoria.

Lentivirus

 

Un subgrupo de los retrovirus, el cual incluye al HIV; pueden infectar células que no se estén dividiendo y son útiles para la terapia in vivo. Suelen usarse especialmente los basados en el HIV y son apreciados por su habilidad de infectar diferentes tipos celulares y porque integran su genoma en el de la célula huésped. Actualmente se estudia la introducción de lentivirus con elevada eficiencia de inserción y, a su vez, gran capacidad de inducir una infección productiva. Mediante la separación de los genes para dos enzimas (RT y IN) necesarias durante el ciclo de replicación del virus, se obtiene un vector "trans-lentiviral" incapaz de producir una infección activa; de esta manera se ve reducido el riesgo del tratamiento para el paciente, aunque no su eficacia. Este "trans-lentivirus" puede ser producido con gran eficiencia en los laboratorios.

Virus Adeno-asociados

Los VAA son Parvovirus no patogénicos que requieren coinfección con adenovirus o algunos miembros de la familia de los virus herpes para lograr la infección.

El genoma del VAA tiene 4,7 Kb. y está flanqueado por 145 pb de unas repeticiones terminales invertidas (IRT). Presentan los genes rep y cap. Los VAA utilizados en terapia génica incluyen las secuencias IRT, el gen exógeno deseado y además un promotor heterólogo, ya que IRT tiene una pobre función promotora

VENTAJAS

No causan enfermedad en el ser humano, ya que son inocuos. Tienen amplio espectro de hospedador y pueden infectar células en/no división. El VAA tipo salvaje se integra de manera específica en el cromosoma del huésped (cromosoma 19 en humanos). Más del 95% del genoma viral puede ser eliminado para insertar DNA foráneo.

DESVENTAJAS

Admiten poco DNA foráneo, aproximadamente 4,7 kb. El VAA integrado puede excindirse del cromosoma hospedador al infectarse simultáneamente con adenovirus y VAA tipo salvaje.

No se ha desarrollado una línea permanente de empaquetamiento. Se pierde el sitio específico de integración al cromosoma 19. Posiblemente al integrarse DNA foráneo se delecionan secuencias necesarias para la integración y se altera este proceso.

Ciclo replicativo de los virus adeno-asociados

Virus herpes simplex

Es un virus encapsulado de DNA de doble cadena que se replica como un episoma en el núcleo del huésped. Su DNA consta de 152 Kb. con dos secuencias únicas U1 y Us flanqueadas por secuencias repetidas invertidas que tienen regiones homólogas y regiones no homólogas.

VENTAJAS

Admiten hasta 30 kb de DNA foráneo. Son neurotrópicos, útiles por tanto como vectores en el SNC. Tienen un amplio rango de hospedadores y se obtienen a elevados títulos.

DESVENTAJAS

Son citotóxicos. Hasta ahora no han demostrado ser eficientes en la infección in vivo y no hay diseminación del virus desde el lugar de la inyección.

Izquierda: estructura de herpesvirus; derecha: foto de herpesvirus humano

La siguiente tabla muestra los tipos de vectores virales usados en terapia génica:

Volver a Índice