INDUCCIÓN DE APOPTOSIS
El control genético de la muerte celular de los tumores se centra en la manipulación del gen anormal p53, presente en algunos cánceres. Las estrategias son la transferencia del gen a la célula tumoral para que una vez allí, induzca apoptosis o bien el uso de vectores adenovirales que ataquen específicamente a las células tumorales carentes de p53. Este tema será desarrollado con detalle más adelante.
ESTRATEGIAS SUICIDAS
Se entiende por genes suicidas los genes manipulados para producir una enzima que hace tóxico un medicamento que en principio es inofensivo al cortarlo en dos, lo que mata a la célula en la que ha penetrado. El gen introducido ha de ser de una enzima que no se encuentre en los mamíferos; tras el gen, han de administrarse elevadas dosis de una pro-droga no tóxica. La enzima escogida catalizará una reacción no existente en las células de mamífero, mediante la cual la pro-droga será metabolizada a su forma tóxica. Teóricamente, la expresión de esta enzima ha de restringirse a las células tumorales para que la droga solamente afecte a éstas sin originar una toxicidad sitémica.
El gen es típicamente portado por un vector viral. Algunos experimentos también han sido efectuados con una enzima viral, resultando en la llamada VDEPT (Virus-Directed Enzyme/Prodrug Therapy).
Experimentos contra linfomas inducidos por virus han usado el ganciclovir (GCV), un sustrato de la timidina quinasa del virus herpes simplex (HSV-TK), en este sentido originando una regresión tumoral e incremento de la vida de los modelos animales en más de 100 días. Otros estudios han sido desarrollados usando la timidina quinasa del virus varicela-zoster (VZV TK) y la citoquina desaminasa de Escherichia coli (CD)
Existen varios nieveles de control de esta estrategia:
La ventaja de la estrategia suicida reside en la habilidad de la célula tumoral transfectada de causar la muerte de las células tumorales sin transfectar debido a la interacción existente entre ambas vía uniones del tipo gap. Ello tembién implica erradicación de células metastáticas e inducción de inmunidad antitumoral. Una gran variedad de estudios con animales ha mostrado inhibición del crecimiento del tumor, reducción del volumen tumoral, regresión tumoral, reducción del índice tumoral, extensión de la superviencia del animal y erradicación de tumores en un ámplio rango de modelos tumorales.
La mayor dificultad reside en dirigir el vector específicamente hacia las células tumorales y en la eficacia de transfección. Ello se puede conseguir por inyección directa en el tumor, aunque es un tratamiento local. Se estudia el uso de vectores virales capaces se dirigirse a los tumores una vez se han inyectado en la circulación sanguínea.
SUPRESIÓN GENÉTICA DEL FENOTIPO TUMORAL
Debido a que la mayoría de cánceres humanos resulta de la expresión y /o deficiencia de expresión de genes específicos, por ejemplo, pérdida de genes supresores de tumores o expresión de oncogenes, el restablecimiento de la función supresora de tumor o la supresión de la función oncogénica mediante transferencia génica puede alterar el fenotipo de las células tumorales.
El número de genes que pueden ser usados con tal fin suele ser estrictamente limitado, normalmente a oncogenes o genes supresores de tumores.
La reversión del genotipo tumoral producido por una mutación negativa (provocada por la activación de un oncogén) puede hacerse corrigiendo la propia secuencia mutada o bien interfiriendo su expresión. La segunda aplicación es más fácil de conseguir; para ello se utilizan elevados niveles de expresión de secuencias antisentido o también ribozimas específicas para el mRNA del oncogén. Se han usado, por ejemplo, oligodeoxinucleótidos antisentido para los genes c-myc, c-muc, H-c-ras, bcrl/abl, PCNA, CDC2 y el factor de crecimiento EGF, mostrando una inhibición del crecimiento y proliferación celular en una gran variedad de tipos celulares in vitro; algunos han mostrado inducir apoptosis en hibridomas de células T. Una ribozima anti-fos revierte completamente el fenotipo de multirresistencia a drogas mostrado por los cánceres de ovario; una ribozima anti-ras, asimismo, altera el fenotipo del melanoma humano in vitro. Estudios in vivo han mostrado que la transfección de un vector antisentido de c-fos resulta en una reducción del crecimiento tumoral, así como de su invasividad, en inhibición de la producción de proteína c-fos, inducción de diferenciación celular y prolongación del tiempo de vida.
Otra estrategia se basa en transfectar células con el gen de la cadena simple de un anticuerpo de una anti-oncoproteína para inducir la producción en las células del anticuerpo, el cual inactive entonces la oncoproteína. Un anticuerpo anti cadena simple de ErbB-2 ha sido usado para mediar la retención intracelular de ErbB-2 mediante su unión al dominio extracelular del mismo, resultando así en un bloqueo del tránsito de ErbB-2 desde el retículo endoplásmico hacia la superficie celular. Esta expresión en fibroblastos resultó en una inactivación funcional del receptor y en la reversión total de la transformación celular.
Por otro lado, la restauración de la heterocigosis funcional para los genes supresores de tumores puede, bajo condiciones ideales, resultar en la reversión del fenotipo neoplásico hacia el normal. Los genes candidatos para tal fin son sin duda aquellos que juegan un papel clave en la supresión tumoral, como los del retinoblastoma (Rb) y el p53.
La introducción de la copia normal del gen Rb en las células de retinoblastoma y osteosarcoma resulta en una reversión del crecimiento celular y de la morfología a las formas normales y suprime la tumorgenicidad de esas células.
La mutación del gen p53 está presente en un amplio rango de cánceres, en un total del 60% aproximadamente. Los cánceres deficientes de p53 suelen ser inestables, agresivos y resitentes a la terapia. Estudios in vivo de restauración de la función p53 han demostrado inhibición del crecimiento celular, cambios morfológicos, disminución de la formación de colonias, inducción selectiva de apoptosis en células tumorales, regresión tumoral, regresión metastática, sensibilización a la quimioterapia y aumento del tiempo de supervivencia del animal. Las evidencias sugieren que p53 es un excelente objetivo para la terapia génica del cáncer, a pesar de que implica una vía compleja en la que intervienen varios factores.
INMUNOESTIMULACIÓN Y TERAPIA GÉNICA
Los esfuerzos para inducir al sistema inmune a eliminar las células tumorales se centran en las numerosas citoquinas existentes que son capaces de reaccionar contra el cáncer: interleucina-2, interleucina-12, interferón-alfa, interferón-ganma, factor estimulador de colonias de macrófafos y granulocitos etc. Los ensayos se han realizado tanto mediante la inyección directa de las citoquinas en el tumor (vacunas tumorales), como mediante su administración vía intravenosa y subcutánea con buen resultado.
Los genes de muchas de estas citoquinas han sido aislados e inyectados en células tumorales, estimulando la producción de citoquinas en dichas células. Ello conduce a una expresión antigénica en la superficie de la célula tumoral, lo que permite la acción de una respuesta inmune selectiva contra estas células mediante la activación de linfocitos T citotóxicos. Esta estrategia permite combatir el tumor tanto a nivel local como sus metástasis, ya que no solamente genera una respuesta a nivel local, sino que también es generada una sistémica con memoria inmunológica. Los ensayos (en la fase II) de inyección de los genes de interleucina-2 o interferón-ganma de manera directa en los tumores han sido bien tolerados, produciendo unas tasas de respuesta inmune del 15-20%, comparables a las producidas tras la inyección sistémica de las citoquinas, aunque reduciendo considerablemente los efectos secundarios.
Muchos de los tratamientos inmunitarios del cáncer se centran en estimular la actividad de los linfocitos del área cercana al tumor. Uno de ellos se basa en la inyección directa del plásmido HLA-7 (Allovectin-7)en el tumor. HLA-7 contiene un gen que facilitaría la unión de las células tumorales a los linfocitos, permitiéndoles identificar y destruir selectivamente los tumores. Este estudio ha presentado buenos resultados y niveles de tolerancia en ensayos en la fase II.
Los pasos para la producción de una vacuna tumoral recombinante incluyen:
De acuerdo con el mecanismo de la respuesta inmune citotóxica, se han usado tres tipos diferentes de genes para las vacunas tumorales:
Varios estudios han sugerido, sin embargo, que B7 no es suficiente para generar regresión tumoral y que se necesitan numerosas citoquinas que interaccionen con ella para generar su función. Se ha sugerido que la IL-10 y el gamma-IFN inhiben la expresión de B7, mientras que GM-CSF y IL-1b la incrementan. Asimismo, IL-2 quizás coopere con B7. Una comprensión mejor de estas interacciones será crucial para el desarrollo de las vacunas basadas en B7.
Otra estrategia es la inmunoterapia basada en las células TIL (Tumor Infiltrating Lymphocyte), unas células derivadas de los tumores extirpados, que incluyen muchos de los macrófagos y las CTLs. Los linfocitos pueden proliferar en gran número en presencia de IL-2 y pueden ser usados para la inmunoterapia sistémica cuando son reinyectados en los pacientes. La administración de TILs junto con elevadas dosis de IL-2 ha demostrado la localización de lugares tumorales en algunos pacientes. TILs unidas a neomicinafosfotransferasa (NeoR) fueron detectadas en circulación durante 189 días y depositadas en los tumores durante 64 días. Las estrategias se basan en la introducción de TILs portadoras de los genes para TNF o IL-2 para introducir así estas citoquinas en las células tumorales. Estudios preliminares con modelos animales en este sentido han demostrado una reducción significativa de metástasis pulmonar y un incremento del tiempo de superviencia en los casos de cáncer cerebral. La dosis máxima tolerada de TNF-alfa por el ser humano es de 8mg/kg, pero su toxicidad impide su uso en la terapia anticáncer humana. Aunque la terapia con TIL por si sola no es suficiente para producir unas tasas elevadas de respuesta, su combinación con la vacunación antitumoral ha producido mejores resultados.
El uso de “linfocitos mensajeros” ( Lymphocyte tumor homing ) se basa en la posibilidad de usar linfocitos, con sus propiedades antitumorales potenciales, como efectores dirigidos contra los tumores. La técnica incluye la transducción del receptor de células T (TCR) dentro de una célula efectora, como CTL. El gen quimérico puede construirse mediante dos técnicas:
El nuevo receptor recombinante de células T induce una especificidad antitumoral de las células T. La esperanza es que el nuevo receptor sea capaz de redirigir genéticamente las células efectoras contra las tumorales y que a su vez esto resulte en su activación para eliminar a las cancerígenas.
Este tratemiento requiere el aislamiento de un gen específico de Ig o bien la fabricación de una cadena simple mAb, lo cual puede no ser práctico para el tratamiento individual de un paciente, aunque sí útil contra tumores expresando antígenos tumorales conocidos o ciertos antígenos virales. Además, aún queda por demostrar si la transducción de un gen extraño en las células TIL tiene algún efecto sobre su función.
ANTIFACTORES DE CRECIMIENTO
Esta estrategia se basa en el uso de sustancias que puedan unirse a receptores de superficie específicos de las células cancerosas, impidiendo así la acción de la molécula que debería unirse a ellos. El modelo conceptual es el del tamoxifeno, la sustancia que desarma los receptores estrogénicos de los tumores estrogenodependientes, sustituyendo a la hormona. Además de para las hormonas, la composición y estructura de los receptores de numerosos factores de crecimiento es bien conocida. De este modo, es posible producir anticuerpos que los reconozcan, se fijen sobre ellos e impidan que el factor correspondiente pueda adherirse y generar una señal de proliferación. Su utilización está próxima y quizás los médicos deberían plantearse el uso de varios anticuerpos simultáneamente, ya que existen múltiples factores de crecimiento y multitud de receptores en la superficie celular. A pesar de la enorme especificidad de la técnica, es probable que no consiga erradicar todas las células de la masa tumoral debido a la presencia de receptores mutados en la superficie de algunas de ellas, que actúan de modo autoalimentado sin necesidad del ligando natural, aunque sí es cierto que muchas células morirán. Así, estos anticuerpos representarán otra arma suplementaria muy útil en la lucha contra el cáncer.
OLIGONUCLEÓTIDOS ANTISENTIDO
Una estrategia en la reducción de la tasa de proliferación consiste en el uso de nucleóticos antisentido, que presentan homologías con productos moleculares de los oncogenes. Se trata de que estos nucleótidos inhiban la función de los productos de los oncogenes mediante una unión estable. Esto es posible porque los oligonucleótidos han sido diseñados para presentar homología con el RNA de los oncogenes. De esta manera, se unen a ciertas partes de la estructura del RNA y lo bloquean, impidiendo la producción de la proteína correspondiente. Con ello se produce una disminución de la tasa de crecimiento del tumor, aunque no su eliminación.
La dificultad sigue siendo la penetración en la célula sin ser degradados por alguna enzima. Es importante tener en cuenta que existe un precio a pagar, pues los oligonucleótidos también penetran en las células normales. Debido a la gran capacidad de variación de las células tumorales, sería necesario inhibir varios genes simultáneamente. Aún así, se espera que esta técnica resulte una buena complementaria de las existentes. Este método suele usarse conjuntamente con quimioterapia.
ANTIANGIOGÉNESIS
Puesto que un tumor es capaz de desarrollarse aunque su entorno presente carencias de oxígeno y nutrientes, debido a su capacidad de inducción de neoangiogénesis a su alrededor, el bloqueo de ésta presenta una estrategia atractiva. Se conocen una serie de moléculas que bloquean la angiogénesis y que, por tanto, son capaces de impedir que un tumor crezca al privarlo de vasos suplementarios. Se están estudiando los agentes que se unen de modo selectivo a los vasos sanguíneos de los tumores.
Los científicos han demostrado en laboratorio que puede matar un tumor tras privarlo de sangre, dejándolo sin oxígeno y nutrición. Tras sólo 48 horas, la técnica había conseguido asfixiar el cáncer de un grupo de ratones que formaban parte de un experimento. En el 38% de los casos, el bloqueo del riego sanguíneo destruyó los tumores por completo, y en los demás ratones, sólo sobrevivieron unas células superficiales que podían eliminarse sin problemas por medio de la quimioterapia.
Las estrategias pueden derivarse hacia un bloqueo directo de la neoangiogénesis o bien hacia la formación de coágulos sanguíneos alrededor de los tumores.
El problema del cáncer es que gracias a su impresionante capacidad para generar nuevas mutaciones de células, a menudo la quimioterapia y otras técnicas similares no pueden ganar la guerra contra esta enfermedad. Sin embargo, la ventaja de esta estrategia sería que las células de los vasos sanguíneos que rodean a los tumores no generan tantas mutaciones, y por lo tanto ofrecerían mucha menos resistencia al tratamiento.
Los científicos han descubierto dos proteínas naturales, la endostatina y la angiostatina, que inhiben la angiogénesis y que, por lo tanto, pueden dejar a los tumores sin los alimentos que necesitan para crecer. Hasta ahora, los creadores de este tipo de técnicas anticancerosas no habían logrado superar un grave problema: la dificultad de producir endostatina y angiostatina en el laboratorio, sobre todo en grandes cantidades. La creación de estas proteínas in vitro no sólo es muy complicada, sino también bastante cara. En una serie de experimentos con ratones, unos investigadores han demostrado que la producción de endostatina se puede estimular en el interior del organismo mediante la inyección de un gen. De esta manera, se puede bloquear la expansión de los tumores cancerígenos con esta proteína, sin tener que generarla en el laboratorio. Para ello se ha diseñado un vector que está compuesto de un polímero cuyo interior contiene un fragmento de DNA con el gen en cuestión. En sus experimentos preliminares, los científicos inyectaron este vector en el músculo esquelético de unos ratones y comprobaron que, a lo largo de aproximadamente dos semanas, el gen estimulaba la producción de endostatina en su sangre. Para comprobar la eficacia de esta terapia contra los tumores, los investigadores inyectaron células cancerosas en el organismo de estos roedores y comprobaron que la endostatina podía inhibir su proliferación. La inyección del gen productor de endostatina era capaz de frenar la expansión de varios tipos de tumores en este modelo animal. Estos resultados demuestran la utilidad que podría tener la inyección de un gen antiangiogénico para combatir la expansión del cáncer.
Gracias a esta terapia génica, es muy posible que se puedan conseguir todos los efectos anticancerosos de la endostatina, sin tener que producirla de una forma artificial. Además, los investigadores señalan que el gen de la terapia produce una cantidad constante de endostatina durante un largo periodo, mientras que con la técnica tradicional de las inyecciones directas el nivel de proteína que contiene la sangre aumenta y disminuye de una forma continua.
A pesar de los alentadores resultados, los invectigadores destacan que la técnica tendrá que perfeccionarse mucho antes de que pueda funcionar con personas.
PERSPECTIVAS DE FUTURO DE LA TERAPIA GÉNICA
TERAPIA GÉNICA IN ÚTERO
Dado que las anomalías patológicas en muchas enfermedades genéticas debutan tempranamente, posterior al nacimiento o en la infancia temprana, este tipo de terapia resulta muy importante más aún en aquellas enfermedades que involucran al SNC, ya que el cierre de la barrera hemato-encefálica durante el desarrollo fetal, determina que el suministro de moléculas terapéuticas al cerebro después del nacimiento se haga difícil.
Una forma de lograr terapia génica in útero es corregir genéticamente la célula hematopoyética originaria pluripotente para transplantes fetales. Este tipo de terapia génica en humanos no ha sido exitoso, dado que la célula transplantada no viaja, sin embargo existen hechos a tener en cuenta que pudieran resolver esta problemática:
Por todo ello, algunos autores afirman que la terapia génica somática puede llevarse a cabo en el embrión, sin el riesgo que implica realizarlo en la célula germinal.
RIBOZIMAS Y ENFERMEDADES DOMINANTES
Hasta la fecha la terapia génica ha estado encaminada a introducir y expresar genes normales en células que contienen defectos genéticos. Sin embargo en ciertas enfermedades como pueden ser las enfermedades genéticas debido a genes estructurales dominantes o en ciertos tipos de cánceres, la corrección del defecto no sólo depende de que se exprese el producto normal, sino que también es necesario inhibir el producto génico anormal.
Para resolver esto se han desarrollado ribozimas (enzimas RNA) que tienen dos dominios, uno que funciona como el sitio catalítico de la enzima y otro que actúa como sustrato (el punto por el cual se rompe).
Si se conoce la secuencia de un RNA, se puede fabricar un oligonucleótido con secuencias que se unan al RNA diana, mediante puentes de hidrógeno y el clivaje puede ocurrir en trans.
La ribozima puede ser suministrada a la célula a través de sistemas virales o no virales.
Esto sería un reemplazamiento génico en lugar de una inserción génica. Hace 10 años varios grupos demostraron independientemente que las células de mamíferos en cultivo, poseían la maquinaria enzimática para llevar a cabo recombinación homóloga.
Una implicación importante de este hallazgo es que se puede reemplazar el gen defectuoso por el gen normal. Esta recombinación homóloga daría solución a las enfermedades dominantes, el cáncer y algunas enfermedades recesivas.