Parazitoloji Laboratuvarı

Parazitoloji Laboratuvar Kuralları

1) DIŞKI MUAYENELERİ:

Güvenlik:

	Dışkı örneği ile çalışan laboratuvarlarda 
potansiyel olarak bulunan tehlikeler şunlardır.
Parazit yumurtası veya kistleri (cysts) yutmak, 
enfektif larvaların deriden geçişi yada dışkıdaki 
veya diğer biyolojik sıvılardaki paraziter olmayan
enfeksiyöz ajanlarca enfekte olmak. Bu riskin oranı 
genel laboratuvar temizlik ve çalışma şartları 
uygulanarak azaltılabilir.
Laboratuvarda çalışırken dikkat edilmesi gereken 
genel kuralları şu şekilde sıralayabiliriz. 

1-Laboratuarda örnek incelerken (çalışırken)
 laboratuvar önlüğü ve lastik eldiven giymek.
2-Gerekli durumlarda biyolojik güvenlik kabini 
kullanılmalı (filtreli özel kabinler).

3-Çalışma ortamında yiyecek yenmemeli, sigara, çay 
v.b. şeyler içilmemeli, makyaj yapılmamalı, kontak 
lens takma-çıkarma-düzeltme yapılmamalıdır. 

4- Çalışma sahası daima temiz ve düzenli tutulmalıdır. 
Akan, dökülen yada etrafa sıçrayan her türlü örnek 
yada maddeler hemen temizlenmelidir. Saha günde bir 
kez dekontaminasyon (bulaşıklardan uzaklaştırma-
temizlik) işlemine tabi tutulmalıdır. 

5-Ellerde bulunan kesik, yırtık v.b. yaralar ve 
ezikler yara bandı veya pansuman malzemeleri ile 
kapatılmalıdır. 

6-Eğer keskin maddeler (bistüri ucu, iğne v.b.) 
kullanılmış ise bunlar hemen özel atık kutularına 
yerleştirilmelidir. Ortada bırakmak yada normal çöp 
kovalarına atmak sakıncalıdır.

7-Eldivenler çıkartılıp uygun biyolojik atık çöp 
kutularına atılır. Eller temizce yıkanır. 


Bu güvenlik kuralları mutlaka uygulanmalıdır. Hatta 
dışkı örneği belli fiksatifler (tespit ediciler) ve 
prezervatifler (koruyucular) içinde dahi olsa yukarda 
ki işlemler yapılmalıdır. Örneğin formalin 
(formaldehit) içerisinde tespit edilmis dışkıdaki bazı 
kalın kabuklu parazit yumurtalarının, kistlerin 
(cysts) yada oocystslerin (ookists) ölmesi için günler-
haftalar gerekebilir. Ascaris lumbricoides’in 
yumurtası formalin içerisinde gelişmesine devam 
edebilir ve infektif duruma gelebilir. 

Dışkı Örneği Toplama:

1.Dışkı kuru ve sızdırmaz kaplar içerisine 
toplanmalıdır. Bu sırada diğer maddeler (idrar, 
toprak, saman v.s.) ile kontaminasyonu (bulaşması) engellenmelidir. 

2.Dışkının kıvamı içeriği hakkında bilgi verebilir. 
Şekilli dışkıda parazitlerin daha çok kistik (cysts) 
formları bulunurken, sıvı (sulu) dışkı kıvamına doğru 
gidildikçe kistik form azalır ancak trophozoit 
(tırofozoid) formları daha çok görülür. İncelemeye 
başlarken bu durum unutulmamalıdır. 
3.Taze dışkı ya hemen incelenmeli yada daha sonra 
incelenecekse zaman geçirmeden prezervatifler 
(koruyucular) içerisine konulmalıdır. Eğer 
prezervatifler hemen kullanılamıyorsa buzdolabında 
kısa süreli saklama yapılabilir. Ancak bu dışkı sadece 
antijen testleri için uygun olacaktır. 

4.Örnekler mümkün olan en kısa sürede prezervatiflere 
konulmalıdır. Eğer ticari bir prezervatif kullanılıyor 
ise bu ürünün kullanım bilgilerine uyulmalıdır. Eğer 
ticari koruyucular kullanılmıyor ise; örnekler ikiye 
ayrılmalı ve uygun kaplarda iki ayrı prezervatif 
içerisine konulmalıdır. Örneğin: % 10’luk formalin ve 
PVA (polivinil alkol) kullanılabilir. Bir hacim dışkı 
üç hacim prezervatif ile karıştırılmalıdır. 

5.	Toplanan örneğin prezervatif ile tam olarak 
karıştığından emin olunmalıdır. Şekilli dışkılarında 
iyice dağılıp, parçalandığından emin olunmalıdır. 

6.	Örnek konulan kapların iyice kapatıldığından 
emin olunmalıdır. Kapaklar parafilm yada benzeri 
maddeler ile yeniden sarılmalı ve kaplar plastik 
torbalara konulmalıdır. 

7.	Belli ilaçlar dışkı içeriğini değiştirebilir. 
Bu durumdaki dışkılar muayene için alınmamalıdır. 
Örnek, herhangi bir ilaç veya madde verilmeden önce 
alınmalıdır. Yada örnek ilaç etkisi geçtikten sonra 
toplanabilir. Bu ilaçlara; antiacid, kaolin, mineral 
yağ veya diğer yağlı maddeler, emilmeyen anti-diyare 
preperatları, baryum yada bizmut (7-10 gün beklenmeli 
atılmaları için), antimikrobiyel ilaçlar (2-3 hafta) 
ve safra kesesi boyaları (3 hafta).

8.	Eğer ilk incelemede sonuç negatif çıkarsa 
örnek alınması tekrarlanabilir. Mümkünse en az üç 
örnek 2-3 gün ara ile alınıp incelenmelidir. 

Örneklerin İncelenmesi:

Dışkı örnekleri taze olarak yada prezervatiflerde 
korunmuş olarak incelenebilir. 


Taze dışkının incelenmesi:
 Taze dışkı 
incelemesi hareketli trophozoitlerin görülebilmesi 
açısından gereklidir. Ancak bu örnek toplandıktan 
sonraki ilk yarım saat (30 dakika) içerisinde 
incelenmelidir. Sıvı (ishal-diyare-diarhoic) dışkılar 
daha fazla trophozoit içerirler. Yumuşak kıvamlı 
dışkılar hem cysts hemde trophozoit formlarını 
barındırabilmektedir. Bu nedenle ilk bir saat 
içerisinde incelenmelidir. Eğer bu süre aşılırsa sonuç 
güvenli olmaz. Çünkü bu süre sonrasında trophozoitler 

parçalanıp dağılmaktadır. Daha kıvamlı (şekilli) 
dışkılar da trophozoit bulunma oranı çok azdır. Bu 
durumdaki örnekler bir süre saklanabilirler. Eğer 
gerekirse buzdolabında korunabilirler. Parazitolojik 
muayenelerde kullanılacak dışkılar kesinlikle 
dondurulmazlar. Dondurulan dışkılardaki parazit 
yumurta ve oocystsleri parçalanırlar. 

Prezervatifli Dışkının İncelenmesi:
 
Dışkı 
inceleme yukarda belirtilen süreler içerisinde 
yapılamayacaksa , örneği prezervatiflerde saklamak 
gerekir.  Bu amaç için kullanılabilen çeşitli 
prezervatifler vardır. En çok kullanılan 
prezervatifler %10’luk formalin, Polivinil Alkol gibi 
preparatlardır. 

Formalin (% 10) ve PVA diğer prezervatiflere göre daha 
fazla avantaj sağladığı için bu iki fiksatif daha çok 
kullanılır. Örneklerin ikiye ayrılarak bu iki 
prezervatiflede tespit edilmesi tavsiye edilmektedir 
(bir hacim dışkı ile üç hacim prezervatif 
karıştırılmalıdır). Prezervatife konulmuş örnekler 
birkaç ay korunabilir.


Formalinde Tespitli Örnekler: 
örnekler direk olarak incelemeye alınabilirler
(ıslak yuva, immunoassay, 
kromotrop boyama) yada yoğunlaştırma (konsantre etme) 
işlemi yapılarak daha sonraki testlerde kullanıma 
hazır hale getirilebilir.

Yoğunlaştırma İşlemleri: Bu işlem parazit veya 
yumurtalarını dışkıdan ayırma işlemleridir. Böylece az 
sayıda bulunan paraziter durumları da teşhis etme 
şansı artmış olur. 
Sedimentasyon (çöktürme) ve flotasyon (yüzdürme)
yöntemleri olarak iki kısma ayrılır.

Flotation (flotasyon)  tekniği: 
Bu yöntemde genellikle sofra tuzu (NaCl), şeker yada 
çinko sülfat (zinc sulfate) solusyonları kullanılır.  
Bu sıvılar organizmadan daha yüksek spesifik  
graviteye (özgül yoğunluğu) sahip oldukları için 
paraziter yapılar yüzüp yukarı çıkarken çoğu dışkı 
kalıntıları dibe çöker. Bu işlemin asıl avantajı 
sedimentasyon tekniğine göre daha temiz inceleme 
maddesi elde edilir. Dezavantajı ise bazı yumurta yada 
kistler (cysts) bu solusyonlar içerisinde 
büzüşebilirler yada bazı parazit yumurtaları 
yüzmeyebilirler. Bu durumda teşhis zorlaşabilir.  

Sedimentation(sedimentasyon)  tekniği:  
Çöktürme işleminde spesifik gravitesi (özgül 
yağunluğu) paraziter organizmalardan daha düşük  olan 
solusyonlar kullanılır. Böylece bu organizmalar 
sedimentin içerisinde yoğunlaştırılmış olurlar. 
Sedimentasyon tekniği genelde çok kullanılır çünkü 
kullanımı ve hazırlanışı kolaydır ve teknik hata yapma 
ihtimali çok azdır. Formalin-etil asetat (formalin-
ethyl acetate) ile çöktürme işlemi çok kullanılan bir 
yöntemdir. Genel olarak kullanılan prezervatiflerle 
toplanmış örneklere de uygulanabilir. 

Formalin-Ethyl Acetate Sedimentasyon Konsantrasyonu 

1.	Örneği iyice karıştırın. 

2.	Dışkı örneğinin yaklaşık 5 ml’sini süzün (çay 
süzgeci yada mikro elek) 

3.	Fizyolojik tuzlu su yada % 10’luk formalini 
süzgeçte kalan kalıntılara dökerek tekrar süzün ve bu 
şekilde 15 ml deney tüpünü doldurun. Distile su 
kullanılması tavsiye edilmez. Çünkü eğer örnekte 
Blastocystsis hominis varsa bu parazit deforme 
olabilir yada parçalanabilir. 

4.	Örneği 10 dakika santrifüj et (1000 rpm-
dakikada devir yada 500g) 

5.	Üstte kalan sıvıyı dikkatlice dök bu sırada 
çöküntü bozulmamalı. Sıvı dökülürken iyice 
sızdırmaktan kaçınılmalı. Son kısımda paraziter 
maddeler olabilir. 

6.	Çöküntü üzerine 10 ml %10’luk formalin eklenip 
tekrar homojen hale getirilir. 

7.	Üzerine 4 ml etil asetat (ethyl acetate) ileve 
edilir ve deney tüpü kapatılıp içerik iyice 
karıştırılır.

8.	Tüp tekrar 10 dakika santrifüj edilir (1000 
rpm-500g)

9.	Tüpün üst kısmında (tepe) biriken dışkı 
kalıntıları bir çubukla tüpten ayrılır.  Üst kısımdaki 
sıvılar dikkatlice boşaltılır.  

10.	ucuna pamuk sarılmış bir çubuk ile tüp 
kenarındaki kalıntılar temizlenebilir. 

11.	Bir kaç damla % 10’luk formalin ilave edilerek 
dipteki sediment sulandırılır ve örnek istenilen deney 
metodu için kullanıma hazırdır. 

 PVA İçerisinde Tespit Edilmiş Örnekler:

Kalıcı Trikrom boyamalar için genellikle PVA 
prezervatif olarak kullanılır. Boyama öncesinde şu 
işlemler yapılır. 

1.	Dışkı örneğinin iyice karışmış olmasına dikkat 
edilir.

2.	Dışkı örneğinden 2-3 damla (dışkı yoğunluğuna 
bağlı) alınarak sürme preperat hazırlanır. 

3.	Preperat ısı ile tespit edilir (60oC – 5 
dakika) yada normal oda ısısında tamamen kurutulur.

4.	Insure that the specimen is well mixed. 

Preperat trikrom boyama yapılabileceği gibi daha 
sonraki boyamalar için bir kaç ay preperat koruyucu 
kutularda saklanabilir.



 Örneklerin Başka Yerlere Nakli:

Bazı durumlarda bölgenizde parazitoloji laboratuvarı 
bulunmayabilir. Bu durumlarda dışkı örnekleri başka 
bölgelerdeki laboratuvarlara gönderilmesi gerekebilir. 
Bu durumlarda dikkat edilmesi gereken hususlar 
aşağıdadır. 

Prezervatifsiz Dışkı Örneklerinin Nakli:

Bazı durumlarda laboratuvarlar şüphenelinen 
patojenleri izole edebilmek için prezervatif 
kullanılmamış örnekler isteyebilirler (örneğin 
microsporidia kültürü yapılacak dışkılar).  Böylesi 
durumlarda örnekler hemen temiz bir kaba konulmalı ve 
gönderilene kadar buzdolabında saklanmalıdır. Örnekler 
alındıktan sonra en kısa sürede  (ortalama 8-12 saat), 
soğuk taşıma şartlarında taşınarak ulaştırılmalıdır. 
Kullanılan kaplar sızdırmaz olmalı ve örnek ile ilgili 
tüm bilgiler kap üzerine yazılmalı yada not olarak 
yanına ilave edilmelidir.  





Prezervatifli Örneklerin Nakli:

Prezervatifli örneklerin nakil kuralları 
prezervatifsiz örneklerinki ile aynıdır. Sadece 
buzdolabında saklamaya ve soğuk taşımaya gerek yoktur. 

Paketleme:

Dışkı örnekleri sızıntıları engelleyecek şekilde 
paketlenmelidir. Paketleme kaba işlemlere dayanıklı 
malzemeden secilmeli ancak depolama, paletli-kızaklı 
sistemlerde hareket edebilir olmalıdır. Örnek hacmine 
göre iki farklı paketleme yöntemi kullanılabilir. 

Hacmi 50 ml’ye kadar olan örnekler:

1.	Nakledilecek mateteryal su sızdırmaz tüp veya 
kaba konulmalıdır (buna birinci nakil kutusu yada 
birinci kutu-kap, denilebilir).  

2.	Birinci kap, su sızdırmaz, dayanıklı bir 
kutuya konulur (ikinci nakil kabı-kutusu)

3.	Birden fazla birinci nakil kutusu, ikinci 
nakil kutusuna yerleştirilebilir ancak toplam hacim 50 
ml’yi geçmemelidir.

4.	Soğuk kaynağı olan buz paketi v.s. yanında, 
sızma ihtimaline karşı emici maddeler de kutuya 
konulmalıdır. Bu maddeler kutu içindeki tüm hacmi 
emebilecek özellikte olmalıdır. Emiciler,  parçalı 
maddelerden, talaş v.s. olmamalıdır.   

5.	Daha sonra bu kutular asıl nakil kutusuna 
(koli, özel taşıma kutusu v.b.) yerleştirilir.

6.	Asıl nakil kutusu üzerinde “Biyolojik 
Madde”, “Tıbbi Malzeme” gibi uygun uyarıcı yazılar 
mutlaka rahatca görülebilecek yerlere konulmalıdır.

Hacmi 50 ml’den fazla olan örnekler:

Büyük hacimli örnekler paketlenirken yukardaki 
kuralların hepsi uygulanmalıdır. Bunlara ilaveten 
aşagıdaki kurallarda yerine getirilmelidir. 

1.	Birinci ve ikinci taşıma kutuları arasına ve 
her yönde şok emici maddeler mutlaka ilave 
edilmelidir. Bu işlemden sonra asıl taşıma kutusuna 
yerleştirilmelidir. 

2.	Birinci taşıma paketi 1000 ml’den (bir 
litreden) fazla örnek taşımamalıdır. Birden fazla 
birinci taşıma kutusu toplam hacimleri 1000 
ml’geçmemek üzere ikinci taşıma kutusuna 
yerleştirilebilir. 

3.	Asıl taşıma kutusu birden fazla ikinci taşıma 
kutusu taşıyacaksa toplam hacim 4000 ml’yi (4 litre) 
geçmemelidir.   

Boyama:

Kalıcı boyama yöntemleri ile boyanmış yayma (sürme) 
prepreperatlar laboratuvarlara avantaj sağlarlar. Bu 
sayede hem kalıcı olarak kayıt tutulabilir hemde 
ihtiyaç olduğunda örnekler yeniden incelenebilir. 
Ayrıca farklı organizma morfolojileri ile 
karşılaşıldığında yada teşhis zorluğu ile 
karşılaşıldığında bu preperatlar referans laboratuvarlara gönderilebilirler. Yukarda sayılan 
nedenler yüzünden her paraziter kontrole gelen dışkı örneğinden en az bir adet sürme preperatın kalıcı 
boyamalar ile boyanması tavsiya edilir. 



Modifiya Asit-fast Boyama :

Bu boyama metodu İsospora, Crptosporidium, Cyclospora 
gibi coccidian parazitlrin teşhisinde kullanışlıdır. 
Trikrom boyamaya göre teşhiste avantaj sağlar. 
Modifiye asit-fast boyamada, Ziehl-Neelsen boyamada 
olduğu gibi boyama maddelerini ısıtmaya da gerek 
yoktur. 

Örnek:

Taze yada formalindeki dışkı örneği çökeltme ile 
konsantre edildikten sonra kullanılabilir. Diğer 
klinik örneklerde (duedonum sıvıları, safra yada 
akciğer sıvıları (balgam, bronş yıkantısı , biyopsi) 
yine bu boyama ile boyanarak incelenebilir.  

Reagentlar (Boyamada kullanılacak Solusyonlar):

Asit-Fast boyamada aşağıdaki solusyonlar hazır 
olmalıdır. 

1.	Absolute Methanol (Saf Metanol)

2.	Asit Alkol

10 ml Sülfirik Asit + 90 ml Absolute ethanol.  Oda 
ısısında depolanmalıdır. 

3.	Kinyoun Carbol fuchsin (Karbol Fuksin)

(ticari olarak satın alınabilir)

4.	Malachite green %3 (Malahit yeşili)

Malahit yeşilinin 3 gramını 100 ml distile suda çözdür 
ve oda ısısında depo et. 

Boyama İşlemi

1.	Dışkı örneğinin sedimentinden 1-2 damla bir 
lam üzerine damlatılıp yayılır. Yayılan dışkı çok 
kalın olmamalıdır. Bu preperat 60°C’de tamamen 
kurutulur. 

2.	Preperat absolut metanol içerisinde 30 saniye 
tespit edilir.

3.	Karbol fuksin ile bir dakika boyanır. Distile 
su ile hafifce yıkanır ve suyu süzdürülür. 

4.	Asit alkol kullanılarak iki dakika boyama 
nötürleştirilir (İstenmeyen boya miktarı 
uzaklaştırılır.)

5.	Malahit yeşili (Malachite green) ile karşı 
boyama yapın. Distile su ile hafifce durulayın ve suyu 
süzdürün.

6.	Preperatı sıcak havada  (60°C) beş dakika 
kurutun. uygun bir lamel ile preperat kapatılabilir.  
İstenilen bölgeler örtülerek incelemeye hazır hale 
getirilir. 

7.	 Preperat mikroskop altında düşük yada yüksek 
büyütmeler ile incelenir. Organizmaların morfolojik 
detaylarını görmek için immersiyon (mineral) yağ 
kullanılabilir. 

Kalite Kontrolü: 

Bir adet kontrol preperatı boyamanın ne denli başarılı 
olduğunu konrol için örnek ile beraber boyanmalıdır. 
Bu amaç için genellikle Cryptosporidium (% 10 ‘luk 
formalinde tespit edilmiş) Kullanılır. 
Cryptosporidiumlar kırmızımsı-pembe renkte boyanırken 
arkaplan yeşil boyanmış olmalıdır. 



Kromotrop Boyama (Chromotrope) İşlemi:

Bu boyama yöntemi trikrom (trichrome) bazı boyama 
maddeleri kullanılarak CDC tarafından geliştirilmiştir 
(Centre for Disease Control and Prevention-USA). Bu 
metod ile microsporidia sporlarını tespit edebilmek 
için kullanılmaktadır.     

Örnek:

Formalin ( %10) içerisinde korunmakta olan dışkı 
örneğinden 10 µl alınarak sürme preparat hazırlanır. 
Preperat ısı ile kurutulup tespit edilir (60°C’de 5-10 dakika). 

Reagents (Solusyonlar):

1.	Absolute methanol 

2.	Chromotrope Stain )kromotrop boya)

Chromotrope 2r  (Kromotrop 
2r)                                    6.00 g

Fast green  )Hızlı 
yeşil)                                                 
  0.15 g

Phosphotungstic acid   (fosfotungistik 
asit)                    0.70 g

Glacial acetic acid (Glasiyal asetik 
asit)                        3.00 ml

Bu maddeleri karıştırıp yarım saat (30 dakika) beklet 
ve 100 ml distile su ilave et. Her ay taze olarak 
kullanmak üzere yenisini hazırla.  

3.	Acid alcohol: (asit alkol)

90% ethanol                                   995.5 ml

Glacial acetic acid                             4.5 ml 

4.	95% ethanol 

5.	100% ethanol 

6.	Xylene (Ksilen) 

Boyama İşlemi:

1.	Örneği (sürme preperat) absolute methanol  
içinde 5 dakika tespit et. 

2.	Kromotrop boya içerisine koyup 90 dakika 
boyama yap 

3.	Boyamayı nötürleştir , asit alkol içerisinde 1-
3 saniye.

4.	Örneği % 95’lik ethanol içerisine batırarak  
asit alkolü durula. 

5.	İki % 100’lük ethanol kabı hazırla ve örneği 
içerisine koyarak (sıra ile) üçer dakika beklet. 

6.	İki ayrı ksilen (xylene yada hemo-de) kabı hazırla ve ayrı ayrı 10 dakika burada beklet. 

7.	preperatı süzdür ve kurutup üzerini uygun 
lamel ile kapatıp tespit et. İmmersiyon oil yöntemi 
ile en az  200 mikroskop sahasını incele. 

Kalite Kontrol:

Formalinde ( % 19) prezerve edilmiş microsporidialı 
olduğu bilinen bir örnekte, incelenecek örnek ile 
boyanırsa boyama kalitesini kontrol etmek mümkün 
olabilir. Microsporidi sporlarının duvarı pembemsi-
kırmızı renkte boyanır ve çapları yaklaşık 1µm 
çapındadırlar. Her 10 preperat boyamasından sonra tüm 
solusyonlar yenilenmelidir. Boyama esnasında durulama 
ve kurutma işlemleri tam yapılmalıdır. 
Microsporidiaları tespit edebilmek için 100X’lük 
büyütme kullanılmalıdır. Pazitif sonuçlar ikinci bir 
eksper tarafından doğrulatılmasında yarar vardır. 

Modifiye Safranin Tekniği (Sıcak Metod)

Cyclospora, Cryptosporidia ve Isospora için kullanılır:

Klinik örneklerinde çoğunlukla Cyclospora oocystleri 
tespitinde Kinyoun’un modifiye acid-fast boyaması 
(soğuk boyama) kullanılır. Ancak, asit-fast boyama 
tekniğinde oocystsler farklı derecelerde boyanırlar. 
Boyanmış, yarım boyanmış yada boyanmamış oocystsler 
aynı örnekte görülebilir. Bu durum yanlış teşhislere 
yol açabilmektedir. Modifiye safranin tekniğinde daha 
üniform (aynı tipte) oocystsler elde edilir. Boyaalr 
ısıtıcılar yardımı ile kaynama noktalarına kadar 
ısıtılırlar.   

Örnekler:

Concentrated sediment of fresh or formalin-preserved 
stool may be used.  Other types of clinical specimens 
such as duodenal fluid may also be stained.

Solusyonlar: 

1.	Asit Alkol  (% 3 HCl/Methanol)

Hidroklorik asidi (3 ml)  yavaşca absolute metanol (97 
ml) içerisine ilave edip ağzı sıkıca kapalı kaplarda 
oda ısısında sakla. 

2.	Safranin Boyası

3.	Malachite Green  (% 3)

Malachite green (malahit yeşili- 3 g)distile su 
içerisinde (100 ml) çözdür ve oda ısısında koru. 

Boyama İşlemi:

1.	İnce yayma (sürme) preperatı hazırla ve kurut.

2.	Alkol içerisinde 5 dakika tespit et. 

3.	Distile su ile dikkatlice durula. 

4.	Kaynamakta olan safranin içerisinde 1 dakika 
boya.  

5.	Distile su ile dikkatlice durula. 

6.	Malachite green  ile1 dakika karşı boyama yap. 

7.	Distile su ile durula ve preparatı kurut. 

8.	Kurumuş preperatı uygun yolla kapat ve 
incele.  

Kalite Kontrol:

İçerisinde Cyclospora olduğu bilinen bir preperat (% 
10’luk formalinde korunmuş olabilir)hazırlanır ve yeni 
incelenecek örnek ile beraber boyanır. Cyclospora 
oocystleri kırmızımsı-portakal sarısı renkte 
boyanırlar. Arka planın unifor yeşile boyanmış olması 
gerekir.

Trichrome Boyama 

Dışkıda intestinal protozoaların incelenmesinde tek ve 
en iyi sonuç veren yöntem dışkıdan ince yayma preperat 
yaparak boyama tekniğidir. Kalıcı boyama ile boyanmış 
preperatlarda cysts ve trophozoit taranması, tanınması 
(bulma ve teşhis etme) ve devamlı kayıt maddesi 
(kanıt) elde edilebilir. Küçük protozoalar ıslak 
yöntemler ile (flotasyon vb) hazırlanan incelemelerde 
görünmeyebilirken (hazırlama veya inceleme hatası vs) 
boyanmış preperatlarda tespitleri daha kolay 
olmaktadır.

Trichrome boyama tekniği hızlı, kolay basit bir boyama 
metodudur.  Bu boyama ile intestinal protozoalar, 
insan hücreleri, mayalar yada diğer maddeler uniform 
olarak boyanmış halde elde edilirler. 

Örnek:

Boyama için kullanılacak olan taze dışkı örneği bir 
lam üzerinde yayma yapılıp hemen tespit edilir. Tespit 
için,

Schaudinn’s fiksative yada polivinil alkol (PVA) 
kullanılır ve havada  veya ısıtılarak (60°C) kurutulur.

Sodium acetate-acetic acid-formalin (SAF-sodyum asetat-
asetik asit-formalin) ile tespit edilmiş örneklerde 
kullanılabilir. 

Solusyonlar:  

1.	Ethanol (% 70) + iodine: 

Etil alkol içerisine iyot kristalleri (iodine) 
ekleyerek bir stok solusyonu hazırla. Solusyon tamamen 
koyu bir renk alana kadar iyot ekle. Bu solusyonu 
kullanacağında kırmızımsı-kahve rengi yada demli çay 
rengi oluşana kadar % 70’lik etanol ilave et. 

2.	Ethanol % 70

3.	Trichrome Boya

4.	Acid-Ethanol % 90

Ethanol  % 90                            99.5 ml

Acetic acid (glacial)                   0.5 ml 

5.	Ethanol  % 95

6.	Ethanol  % 100

7.	Xylene (Ksilen)

Boyama İşlemi:  

1.	Taze örneklerde preperatı Schaudinn’s 
fiksativinden çıkartıp % 70 ethanoliçerisinde 5 dakika 
beklet. Daha sonra % 70 Ethanol + iodine koyup bir 
dakika beklet. Eğer örnek PVA yayması ise preperatı % 
70 ethanol + iodine içimde 10 dakika beklet.

2.	Preperatı % 70 Ethanol de 5dakika beklet. 

3.	Preperatı ikinci % 70’lik Ethanol içinde 3 
dakika beklet. 

4.	Trichrome boyaya koyup 10 dakika beklet. 

5.	Fazla boyaları % 90’lık ethanol + acetic acid 
ile uzaklaştır (1veya 3 saniye). 

6.	Örneği % 100 ethanol ile bir kaç defa durula. 

7.	İki kademeli % 100’lük ethanole koy (her biri 
3 dakika). 

8.	İki kademeli xylene (ksilen) koy (her birinde 
10 dakika). 

9.	Uygun lamel ile preperatı kapatıp yapıştır.

10.	Mikroskopta 100X objektif ile (immersiyon oil) 
en az 200 mikroskop sahası incele.  

Kalite Kontrol:

İçerisinde protozoa bulunduğu bilinen (Giardia gibi) 
PVA içerisinde tespit edilmiş bilinen bir örnek 
kontrol örneği olarak bilinmeyen örnekle beraber 
boyanmalıdır. Düzgün olarak tespit edilmiş ve doğru 
boyanmış preperatlarda protozoa trophozoitlerinin 
stoplazması mavimsi yeşil veya morumsu renklerde 
belirir. Cysts (Kistler) daha morumsu olarak 
belirirler. Çekirdek ve diğer yapılar (kromatid 
yapılar, bakteriler ve alyuvarlar) bazan mora kaçan 
kırmızı renkte görülürler.Glikojen solusyonlarda 
eridiği için bu bölgeler temiz alanlar olarak belirir. 
Geri plan ise genellikle yeşil renk boyanır ve iyi bir 
renk zıtlığı oluşturarak parazitlerin daha iyi 
belirmesini sağlar. 



Mikroskobik İnceleme

Oküler Mikrometre kullanılarak Mikroskopların 
Kalibrasyonu:

Doğro olarak kalibre edilmiş mikroskoplar 
incelemelerde çok önemlidir. Çünkü organizmaların 
özellikle parazitlerin büyüklükleri önemli bir teşhis 
aracı olarak kullanılır. Kalibrasyon için iki mikro 
metre kullanılır. Birinci mikro metre okülere 
yerleştirilir. İkinci mikrometre mikroskop sehpasında 
konulur ve her büyütmede iki mikrometrenin ne kadar 
çakıştığı belirlenir. Sehpadaki mikrometrenin, 
okülerde nekadar görüldüğü ve görülen mesafenin 
aslında nekadar olduğu ile oranlanarak kalibrasyon 
yapılır. Bu işlem her mikroskop için ayrı ayrı 
yapılmalıdır. 

Mikrometreyi sehpaya yerleştirip net ayarını yap ve 
hem 0.1 mm hem de 0.01 mm çizgilerini görüntüle. 
Okülerdeki mikrometrenin “0” çizgisi ile sehpadaki 
mikrometrenin “0” çizgilerini çakıştır. Daha sonra, 
diğer kısımda kalan bölümlerden hem sehpa hemde 
okulerdeki metrelerden tam olarak çakışan iki çizgi 
bulunur (bu iki aramesafenin mümkün olan en uzak 
mesafelerden seçilir). Okülerdeki bu mesafe ile 
sehpadaki mesafe arasınad oran kurularak kalibrasyon 
tamamlanır. Örneğin sehpadaki mikrometrenin 36 bölmesi 
okulerdeki 0.7 mm çizgisi ile çakıştı bu durumda 
0.7/36= 0.019mm olarak hesaplanır.Yani okülerde sizin 
1 mm olarak gördüğünüz cisim aslında 0.019 mm 
büyüklüğünde demektir. Genelde bu ölçümler milimetre 
yerine, mikrometre cinsinden verilir. Bu durumda 
mesafe 1000 ile çarpılır sonuç 19 µm olarak bulunur 
yani her bölüm her ünite (kesik çizgiler arası) bu 
mesafeye eşittir. Bu işlem her büyütme için ve her 
mikroskop için ayrı yapılır. Ayrıca mikroskop 
obyektif, oküler değişimleri vya genel temizlikleri 
sonrasında tekrarlanmalıdır. Kalibrasyon işlemi 
sonrası mikroskop yanına bu işlem sonucu 
kaydedilebilir. 

Basit Yayma Preperat Hazırlanması:

Bu işlem öncesinde mikroskoplarda kalibrasyon 
işleminin yapılmış olması tavsiye edilir. 

Protozoan trophozoitleri, cysts, oocysts ve helminth 
yumurtaları ve larvalarbu yöntemle görülüp teşhis 
edilebilir.  

Bu işlem  için bir lam, lamel ve dışkı örneği 
gereklidir. Az bir miktar dışkı alınıp lam üzerine 
konur. eğer dışkı hala kıvamlı ise bir iki damla su 
veya tuzlu su ile sulandırılır. Genellikle en az iki 
örnek hazırlanması istenir. Bu sayede bir örnek iyot 
ile boyanabilir. Bu yaymada dışkı kalınlığı çok 
olmamalıdır. Lam altına konulan yazılar üstten 
görünebilmeli ve okunabilmelidir (bak resim1). 



 

Eğer arzu edilirse lamel, lam üzerine 
yapıştırılabilir. Bu işlem için en ucuz ve kolay elde 
edilebilen madde tırnak cilalarıdır (oje). İlk olarak 
lamelin dört köşesi birer damla ile tespit edilir. 
Daha sonra oje lamel etrafına açık kısım kalmayacak 
şekilde sürülür ve kurumaya bırakılır. Bu şekilde 
hazırlanan preperatlar uzun süre saklanabilir. 
Saklanacak preperatlarda tuzlu su kullanılmamalıdır. 
Bu işlem için diğer yapıştırıcılarda kullanılabilir. 



 


Preperatı sistematik olarak incele. Bu işlem ilk 
olarak 10 X objektif ile yapılmalıdır. Her hangi bir 
nesne incelenmek istenirse o zaman büyük büyütme ile 
inceleme yapılır. 



 

 







Boyanmış Preperat Hazırlanması:
Kalıcı boyamalar ile hazırlanmış olan preperatlar 
protozoan trophozoites ve cystlerini teşhis etmek yada 
tür tayini yapmak için hazırlanır. Ayrıca daha sonraki 
çalışmalar için kaynak oluşturur (uzman incelemeleri 
vs).

İnceleme öncesinde çalışma ortamında aranan  organizma 
ile ilgili kaynaklar (kitap, resim yada pozitif olduğu 
bilinen preperatlar) hazır olmalıdır. Hangi boyama 
yapılacağı aranan organizmaya göre belirlenir. 
Normalde her 3 örnekten bir tanesi kalıcı boyamalar 
için hazırlanılması tavsiye edilir. Eğer dışkı örneği 
prezervatifsiz olarak gelmiş ise hemen bir baget 
(çubuk) ile biraz dışkı alınıp bir lam üzerine 
sürülerek yayma yapılır. Dışkı çok kıvamlı ise bir iki 
damla su ile sulandırılabilir. Bu preperat hemen 
Schaudinn'in fiksativine konur. Bu aşamada preperat 
kurutulmaz, kurumamasına dikkat edilir. Eğer PVA ile 
tespit edilmiş örnek gelirse bir iki damla alınıp lam 
üzerine homojen olarak ve yaklaşık 22x22 
genişliğindeki lamel alanı kadar yayılır. 

Boyama işlemi tamamlandıktan sonra preperat sistemik 
olarak incelenir. Bu işlem için 100x objektif 
kullanılır. En az 200 yada 300 mikroskop sahası 
taranır. Eğer varsa görülen protozoa cysts yada 
trophozoitleri tespit ve teşhis edilir ve rapor edilir.  

 















Thank you for visiting my page at Angelfire. Please come back and visit again!



My Favorite Web sites

Angelfire Home Pages

Free Web Building Help

Angelfire HTML Library










Email:  galipkaya@hotmail.com