Parazitoloji Deneyleri Flotasyon da Kullanılan Solusyonlar: Parazit yumurtaları su içerisinde dibe çöktükleri için, tuz yada şeker solüsyonları yumurtaları konsantre etmek için kullanılır. Bu amaçla genellikle sofra tuzu (NaCl), Şeker (sukroz), sodyum nitrat ve çinko sülfat kullanılır. Bu solüsyonların spesifik graviteleri (özğül yoğunlukları 1.2-1.3 arasındadır ve bir çok parazit yumurtasını yüzdürmeye elverişlidir. Her solüsyonon avantaj ve dezavantajı vardır. Magnezyum sülfat pahalı değildir fakat bu şekilde hazırlanmış preperatlar inceleme öncesinde beklemek zorunda kalırsa, solüsyon kristalleşmeye başlar ve parazit yumurtalarını parçalayabilir. Şeker solüsyonu preperatların inceleme öncesinde daha uzun süre dayanmasını sağlar ancak yapışkan bir hal alır ve daha pahalı olabilir (Cryptosporidium oocysts incelemelerinde özellikle tavsiye edilir). Sodyom nitrat direk solüsyon olarak satın alınabilir ve hazırlık devresi aradan kaldırılabilir ancak oldukca pahalıdır. Çinko sülfat Giardia cystslerini teşhiste çok elverişlidir çünkü bu cystsler diğerlerinde olduğu gibi çabuk bozulmazlar. Flotasyon Metodunda kullanılan Solüsyonların Hazırlanması: o Magnezyum Sülfat (Magnesium sulfate) solüsyonu sp.gr. 1.2: § Dokuz litre su § 4.54 kilogram mağnezyum sülfat. o Şeker Solüsyonu (Sukroz-Doymuş-Sature) sp.gr. 1.27: § 454 gram toz şeker § 355 ml su § 6 ml % 40 formaldehyde § Suyu ısıtıcı üzerine yerleştirilip ısıtılır ve şeker eritilir. Solüsyon kaynadıktan sonra formaldehyde ileve edilir. o Çinko Sülfat (zinc sulfate) solüsyonu sp.gr. 1.18: § 336 gram ZnSO 4 ·7H 2 O § 1000 ml distile su Magnezyum Sülfat Kullanarak Yüzdürme Tekniği: Protozoan kistleri (cysts), nematod, cestod ve bazı arthropodların yumurtalarını yüzdürmede (flotasyonla konsantre etme) kullanılır. Üzerinde kapak taşıyan (opeculum) yumurtalarda kullanılmaz. Materyaller: o Düz ağızlı santrifüj tüpü (12 ml yada 15 ml) o Santrifüj o Cam yada tahta bagetler (Çubuklar) o Küçük kaplar (Küçük beher yada benzeri kap) o Tülbent bezi yada benzeri yapıda bez o Su o Flotasyon Solüsyonu (Tuz, Şeker yada MgSO 4 solution) o Lam-Lamel İşlem: o Bir santrifüj tüpü içerisinde az bir miktar ( bir çay kaşığı) dışkıyı alıp su ilave edip iyice karıştırarak yumuşak bir kıvam alması sağlanır. o Yüzdürme solüsyonu eklenir ve tüp üzerinde hafif bir bombe (kabartı olması) sağlanır. Lamel Bu kabartı üzerine yavaşca yerleştirilir. Lamel altında hava kabarcığı kalmamalıdır yada içerik taşırılmamalıdır. o Tüp, 3 dakika 1000 rpm (500 g ) santrifüj edilir (santrifüj olmadığında 20 dakika beklenir). o Lamel alınıp lam üzerine yerleştirilir ve mikroskopta incelenir. o Kullanılan malzemeler yıkanıp ortam temizlenir. Not: Hayvan dışkıları bir çok yabancı madde içerir. Bu durumda dışkıyı sıvı kıvam alana kadar solüsyon ile karıştırıp süzmek ve daha sonra flotasyon işlemine geçmek tavsiye edilir. Basit Yöntem ile Sedimentasyon (Çöktürme) Materyal o Beher o Spatula veya baget o Süzgeç (çay süzgeci) İşlem: o Beher içerisine yaklaşık 10 gram dışkı konulur ve bağet yardımı ile iyice karıştırılır. o Süspansiyon süzgeç yardımı ile süzülür. o Süzüntü bir saat bekletilir ve üstteki sıvı kısım dikkatlice dökülür. Dipteki çöküntü rahatsız edilmez ve sıvı tamamen boşaltılmaz. o Gerekirse işlem birkaç kez tekrarlanır. o Dipteki çöküntü iyice karıştırılır ve 1-2 damla cam baget ile alınıp lam üzerine konur. o Lamel kapatılarak yada kapatılmadan örnek incelenir. Not: İstenirse %1’lik metilen mavisinden bir damla konularak örnek boyanabilir. Boyama, yumurta haricindeki maddeleri maviye boyar. Yumurtalar sarımsı renkli olarak boyanmadan kalır. Bu durum teşhisi kolaylaştırır. Telemann Yöntemi ile Çöktürme: Materyal: o Asetik asit (% 5) o Ether o Santrifüj ve deney tüpleri Süzek (ince gözlü) o Cam baget İşlem: o Bir gram dışkı alınır ve % 5’lik asetik asit içerisinde iyice karıştırılır. o Bir dakika bekletip süzülür. Süzüntü deney tüpüne konur. o Eşit miktarda eter örneğe katılır. o Deney tüpünün ağzı kapatılıp örnek iyice çalkalanır. o Tüp santrifüje yerleştirilir ve bir dakika 1500 devirde çevrilir. o Santrifüj sonrasında Tüpte üç katman görülür. En üstte eter katmanı, altında asit katmanı belirir. Bu iki katman arasında bir kir tabakası oluşabilir. Bu tabaka cam baget ile yerinden oynatılır. En altta ise bir sediment oluşur. o Eter ve asit katmanı aynı anda dikkatlice dökülerek atılır. o Tüpün dibindeki çöküntüde yumurta aranır. Bir iki damla çöküntü alınıp sulandırılır (1-2 damla su) ve küçük büyütmede incelenir. Modifiya Viskonsin Metodu İle Yumurta Sayımı: Modifiye Wiskonsin yöntemi ile yumurta sayımında flotasyon tekniği kullanılır. Bir hayvandaki parazit miktarını belirlemek amacı ile yapılır. 1. Küçük bir kap içerisinde 2 gram dışkı tartılır (sığırlarda 5 gr) 2. Kap içerisine 10 ml su ilave edilir ve karıştırarak dışkı tamamen parçalanır. 3. Kaptaki içerik çalkalanarak süzeğe dökülerek karşım süzülür, (Tülbent bezi yada süzek ile) süzekte kalan partiküller bir baget yada spatula ile bastırılarak suyu iyice sızdırılır. 4. Kap içerisine az bir miktar su konulup içi çalkalanır ve süzeğe dökülür. 5. Süzüntü (süzülen sıvı) 15 ml’lik bir deney tüpüne konulur. Örnek tüpü doldurmalıdır (15 ml). 6. Tüp 1500 devirde (rpm) 10 dakika santrifüj edilir. 7. Tüp içerisindeki sıvı dikkatlice dökülür, dipteki sediment rahatsız edilmez. 8. Tüp yarıya kadar MgSO 4, (sp.gr. 1.2-1.25) ile doldurulup tüpteki sediment homojenize edilir. 9. Tüp flotasyon solüsyonu ile tamamen doldurulur. 10. Bir damlalık ile tüp üzerinde bombe oluşturulur ve lamel tüp üzerine yerleştirilir. 11. Örnek santrifüj edilir 1500 devirde 10 dakika (500 g) 12. Lamel dik olarak yukarı kaldırılır (yanlara eğilmeden) ve lam üzerine konulur. 13. Küçük büyütmede (10 X objektif) lamel üzerindeki bütün yumurtalar sayılır. 14. Sonuç rapor edilir. Rapora örnek adı veya numarası, toplanma ve incelenme tarihi, kaç tane yumurta görüldüğü ve hangi türlere ait olduğu dikkatlice yazılır. 15. Burada sayılan yumurtalar iki gramdaki (sığırlar için 5 gr) yumurta sayısını verir. Yumurta Sayımının Önemi: Yumurta sayımları ilaç kullanımlarından önce ve sonra yapılarak ilaç kullanımlarının başarısını değerlendirmede yada ilaca dirençli organizmaların tespitinde önemli rol oynar. 1. Dışkıdaki yumurta sayısı bazı etkilerden dolayı değişir. Bunları şöyle sıralayabiliriz. o Dışkının kıvamı, Kuru dışkıda tartım sırasında daha fazla dışkı maddesi alınmış olur (su miktarı az olduğu için). Bu nedenle yumurta sayısı daha fazla çıkabilir. o Hayvanın çıkardığı toplam dışkı miktarı o Dışkının toplandığı saat (örnek alım saati). Gün içerisinde dışkı ile atılan yumurta sayısı değişir. o time of day feces collected 2. Yumurta sayısının önemi hem konakçıya göre hemde parazit türüne göre değişiklik arz eder. Her tür için (konakçı veya parazit) bölgesel ortalamalar çıkartılmalıdır. o Nematod Türleri İçin, bir gram dışkıda; § Atlarda § 500 yumurta = Hafif enfeksiyon § 800-1000 yumurta = orta şiddette enfeksiyon § 1500-2000 = Ağır enfeksiyon § Sığırlarda § 300-600 yumurta =Tedavi gerektirir § Kuzularda –Parazit türüne bağlı olarak değişir ancak ortalama. § 1000 yumurta = orta şiddette enfeksiyon, tedavi gerekli § 2000-6000 = Ağır enfeksiyon o Trematode Türleri için; (örnek: Fasciola hepatica ) § Sığır 100-200 yumurta patojenik kabul edilir. § Koyun 300-600 yumurta Patojenik kabul edilir. Yukarda örnek bir liste verilmiştir. Buradaki değerler değişebilir. Bazı hallerde parazit patojenitesi yada konakçı direncindeki farklılıklardan dolayı ortaya çıkan hastalık tablosu, yumurta sayısının işaret ettiği tablodan daha ağır yada hafif şekillenebilir. Modifiye McMaster Yöntemi ile Yumurta Sayımı: Bu yöntemde McMaster lamı kullanmak gerekir. McMaster lamı bir lamel üzerinde iki kuyucuk bulunur bu kuyucuklar hazırlanan örnek ile doldurulup sayım yapılır. Kuyucuklar üzerine kapatılan lamelde 1 santimetre karelik bir alan işaretlenmiştir. Lamel ile kuyucuk tabanı arasında 0.15 cm’lik bir yükseklik vardır. Bu nedenle işaretli alan içerisinde 0.15cm3 ‘lük bir hacim vardır. Yani işaretli kısımda 0.15 ml sıvı vardır. İki kuyucukta da işaretli alan içerisinde kalan yumurtalar sayılır. İşlem: 1. 42 ml doymuş tuzlu su bir kap içerisine konur. 2. 3 gram örnek dışkıdan tartılıp bu kaba ilave edilir. 3. Bu kaba bir miktar cam boncuk (0.3-0.5 mm çaplı) konularak ağzı sıkıca kapatılıp çalkalanır. 4. Yada uygun bir başka yolla dışkı homojenize olanakadar karıştırılır. 5. Karışım bir süzgeç ile süzülür. Süzekte kalan atıklar atılır (cam boncuk temizlenip tekrar kullanılabilir) 6. Süzüntü iyice karıştırılır, plastik pasteur pipeti ile bir miktar alınıp McMaster lamındaki kuyucuklardan bir tanesi doldurulur. 7. Örnek tekrar karıştırılıp bir miktarı alınır ve ikinci kuyucuk doldurulur. 8. McMasterlamı mikroskop altına yerleştirilir ve kısa bir süre yumurtaların flotasyonu için beklenir. 9. Mikroskobun netlik ayarı yapılıp her kuyucukta sınırlanmış bölmeler sayılır. Hesaplamanın yapılması: Her iki kuyucuktan sayılan yumurta sayısı bir kenara kaydedilir. Üç gram dışkı 45 ml’de (42+3) homojenize edildiği için, bir gram dışkı 15 ml sıvı içinde demektir. Her bir küçük bölme 0.15 ml sıvı almaktadır her kuyucuktan iki bölme sayıldığı için bir kuyucuktan toplam 0.3 ml deki yumurta sayısı elde edilmiş olur. Sonuç 50 ile çarpılır ve bir gram dışkıdaki yumurta sayısı elde edilmiş olur. Dışkıda Trematode Kontrolü: Materyal: 10. 2 adet küçük kap (her hayvan için) 11. 1 adet çay süzgeci (yada benzeri büyük süzgeç) 12. 1 adet 50 ml Santrifüj tüpü (her hayvan için) 13. Sabunlu su solüsyonu (binde birlik). 14. Spatula (Tahta yada plastik spatula) İşlem: 1. Örnek dışkıdan 3 gram bir kapta tartılır. 2. Dışkı sıvı-sulu bir kıvam alana kadar su ile karıştırılır. 3. Başka bir kap içerisine süzülür ve 50 ml santrifüj tüpüne boşaltılır. 4. Sabunlu su ile örnek karıştırılarak, tüp ağzına kadar doldurulur. 5. Tüp 3 dakika bekletilir ve üstte kalan sıvı dikkatlice dökülür (yaklaşık 1-2 ml sıvı tüpte kalır. 6. Bu işlem üç defa (yada örnek oldukça açık renkli olana kadar) tekrarlanır. 7. Son işlem sonrasında tüpte kalan içerik bir petri kabına dökülür ve tüp çalkalanıp içerik petriye boşaltılır. 8. Petri kabı, stereo mikroskop altında incelenir ve içindeki yumurtalar sayılır. 9. Çıkan sayı üçe bölünerek bir gram dışkıdaki yumurta sayısı bulunur. Dışkı Kültürü Yapılması (Baermann Apparatusu ile Larva Aranması): Materyal : 1. Büyük Huni 2. Kauçuk hortum (huni çapına uygun) 3. Tülbent bezi 4. Su ve cam malzeme (beher, erlen) 5. Pasteur pipeti 6. Kelepçe (Kauçuk boruyu sıkıştırmak için) İşlem: 1. Huni bir sehpaya yerleştirilir ve kauçuk hortum ucuna takılıp kelepçelenir.. 2. Tülbent bezi ikiye katlanır ve huni içerisine yerleştirilir (dışkı sıvı ise tülbent daha çok katlanabilir). 3. Yaklaşık 20 gram örnek alınır ve huniye yerleştirilir. 4. Huni içerisi su ile doldurulur. 5. Bir gün oda ısısında bekletilir. 6. Kelepçe yavaşça açılır ve 1-2 damla bir beher yada erlene alınır. Modifiye Baermann Tekniği: Burada açıklanacak olan teknik, nematoda’lardan, Strongylida takımına ait türlerin yumurtalarından kültür yapıp enfektif larvaların elde edilmesinde ve daha sonra teşhis amaçlı kullanılmasında yararlıdır. Birinci aşamada yumurtalar kültür yapılıp gelişme süreleri kısaltılır (enfektif L’3lerin oluşumu hızlandırılır). Baermann tekniğinin bir çok modifikasyonu mevcuttur. Burada amaç üçüncü dönem larvaların dışkıdan dışarı göç etmeleri sırasında onları toplamaktır. Oluşturulan düzenek içinde dışkıdan çıkan larva su ile temas eder. Larvalar suda yüzemezler ve özgül ağırlıkları fazla olduğu için dibe çökerler. Bu şekilde düzenek tabanında toplanan larvalar alınıp teşhis için kullanılırlar. Materyal: 7. Lastik eldiven ve örnek kabı. 8. Laboratuvar terazisi (hassas terazi) 9. Beher ve erlenmayer (250 ml) 10. Tahta spatula yada baget 11. Petri kutuları (10x1.5 cm ve 15x 2.5 çaplı) 12. Tülbent bezi yada mermer şahi benzeri bez. 13. Kauçuk bandı 14. Lugol solüsyonu. 15. Santrifüj ve santrifüj tüpleri. 16. Pasteur pipetleri (cam ve plastik) 17. Mikroskop, lam, lamel. İşlem: 1. Örnek dışkı rektal yolla temiz bir kap içerisine alınır. Bu sırada çevresel bulaşmalardan sakınılmalıdır. Doğada serbest yaşayan nematadlor bulaştığında teşhiste yanılgılara yol açabilir. 2. Beş gram dışkı tartılır ve bir beher içinde spatula yardımızla parçalanır. Eğer örnek sığır yada köpek dışkısı ise bir miktar temiz talaş yada steril humuslu toprak (çiçekçilerde satılan iyi kalite toprak veya talaş ) ile karıştırılıp ılık su ile kıvam verilir. Örnek at, koyun veya keçiden alınmış ise bu işleme gerek yoktur. . 3. Örneği petri kutusuna koyup sıkıştırılır ancak örnek birbirine yapışmamalı. Petri kutusu kapatılıp oda ısısında 14 gün bekletilir (At dışkısında 7 günlük 30 oC ön bekletme uygundur). Bekletme sırasında küf veya mantar üremeleri olabilir bu normaldir. 4. Bekletme sonrasında petri açılır ve üzeri iki katlanmış tülbent ile örtülür. Örtünün fazla kısımları kesilip kenarları petriye yapıştırılır. 5. Petri ters çevirilip içi 100 ml ılık su ile dolu daha büyük bir petri içerisine tabanında boşluk kalacak şekilde yerleştirilir (iki çubuk tabana konup bezli yüzey aşağı dönük olacak şekilde petriler iç içe yerleştirilir). Petri içerisinde hava kabarcığı kalmamasına dikkat edilir ve kapatılır. Bu şekilde yaklaşık bir gün bekletilir (18-24 saat). 6. Bezli petri ve çubuklar çıkartılıp temiz su ile durulanır. Durulama suyu da örneğe eklenir. Örneğe ayrıca 0.3 ml lugol ilave edilir ve karıştırılır. 7. Sıvı bir santrifüj tüpüne aktarılır ve 1000- 1500 rpm de 10 dakika santrifüj edilir. Eğer santrifüj yoksa örnek tabanı kapalı huni yaad benzeri bir kaba konur ve 10 dakika çökmesi beklenir. 8. Bir damla örnek kabın tabanından alınır (pasteur pipeti ile) ve lam üzerine konur. Lamel kapatılarak üçüncü dönem larvalar mikroskop altında aranır. Eğer larva varsa uygun kaynak kitaplardaki çizimler ile hangi tür parazit yada parazitlerin larvaları olduğu teşhis edilir. Modifiya Knott Metodu ile Mikroflaria Taraması: Modifiye Knott yöntemi, microflariaların yoğunlaştırılması ve incelenmesinde kullanılır. İşlem: 1. Bir ml kan alınır ve 9 ml % 2 formalin (% 37 formaldehyde 2 ml + H2O 98 ml) ile karıştırılır. 2. Beş dakika 1000-1500 rpm de santrifüj edilir. 3. Sediment rahatsız edilmeden sıvı dökülür. (Tüp ters çevrilip bir kağıt havlu üzerine konarak sıvının tamamen süzülmesi sağlanabilir). 4. Sediment eşit miktarda metilen mavisi (1:1000) ile karıştırılır. 5. Bir-iki damla lam üzerine yayılıp incelenir. 6. Hem ince hemde kalın yayma yapılmalıdır (tercihen her iki yöntemde de ikişer preperat) 7. Preperatlar kururtulur ve absolute metanol içerisinde bir kaç dakika tespit edilip boyanır. Deri Uyuzu Teşhisi: Epidermal hiperplazinin (deri kalınlaşmasının) en az olduğu kısımlar seçilir. Uyuz etkeninden (Psoroptes, Sarcoptes, Demodex) şüphelenilen lezyonların kenar kısımları kazıntı yapmak için hazırlanır. 1. Temiz bir bistüri ucuna 1-2 damla mineral yağ damlatılır. 2. Bistüri ucu deriye dik tutularak kazınmaya başlanır. Deri kanayana kadar kazınır. 3. Bistüri ucunda biriken kazıntı alınıp mikroskop altında incelenir. Kulak İncelemesi: Kulakta yerleşen aracnidaların incelenmesi için 1. Ucuna pamuk sarılmış uzun bir plastik çubuk kulak içerisine sokulup, kulak kanalı kenarları sıyrılır. o Pamuk bir damla mineral yağ ile ıslatılırsa kulak keanrındaki aracnoidlerin pamuğa yapışması artırılabilir. 2. Pamuk üzerinde toplana maddeler lam üzerine aktarılıp mikroskopta incelenir. Trichinella Spp. Teşhisi: Ülkemizde domuz Yetiştiriciliği yaygın değildir. Bu işlem ek bilgi olarak verilmiştir. 1. Bir miktar taze domuz eti alınır. o Musculus masseter yada diyafram örnek alınması için uygundur. 2. Az bir miktar doku lam üzerine konur. 3. İkinci bir lam ile doku kapatılır. 4. İki lam parmaklar arasında dikkatlice fakat sıkıca sıkıştırılır. 5. Lamlar gevsetilmeden bir bant (selobant) ile yapıştırılır. Etrafa doku taşmış ise kesilip atılır. 6. Mikroskop altında küçük büyütmeler ile incelenir ve cystler aranır. Thank you for visiting my page at Angelfire. Please come back and visit again!
My Favorite Web sites
Angelfire Home Pages
Free Web Building Help
Angelfire HTML Library
htmlGEAR - free polls, guestbooks, and more!
Email: galipkaya@hotmail.com
