ACTIVACIÓN DE LOS GENES “LATE”
Las regiones codificadoras de los genes tardíos en los adenovirus se encuentran organizadas en una gran unidad de transcripción, cuyo transcrito primario tiene unos 29,000 nucleótidos de longitud. Este transcrito es procesado por utilización de sitios poliA y splicing diferenciales para generar al menos unos 18 mRNAs distintos, que pueden ser agrupados en 5 familias denominadas de L1 a L5. La expresión de esta extensa familia de mRNAs es controlada por el major late promoter, cuya actividad va incrementándose a lo largo del progreso de la infección. Parece ser que al menos dos componentes distintos contribuyen en su activación: el cambio en las secuencias cis-acting del cromosoma viral y la inducción de al menos un nuevo factor trans-acting codificado en el virus. Puede ser que sea necesario alterar los constituyentes de la cromatina viral durante el proceso de replicación para activar el major late promoter, ya que la cromatina no replicada se asocia a diferentes proteínas que la cromatina que ya se ha replicado. El DNA viral así quedaría unido a las proteínas del core hasta producirse la unión de las histonas durante la replicación. Sin embargo, esta hipótesis parece no cumplirse, ya que no se ha encontrado que el genoma de adenovirus se una a histonas celulares. Quizás, el proceso de replicación permite la transcripción de factores que accedan al promotor. Alternativamente, las proteínas del core podrían sufrir un proceso progresivo de descondensación y dejar el promotor accesible a la maquinaria de replicación. Los diversos dominios del cromosoma podrían quedar accesibles siguiendo una secuencia ordenada, quedando así el promotor encargado de la fase tardía expuesto mucho más tarde que el de la fase temprana. También podría ser que el cromosoma viral creara una especie de compartimento dentro del núcleo celular, evitando el acceso de los factores necesarios para la fase tardía.
Se ha determinado que el factor transcripcional llamado MLTF se une al major late promoter, aunque su papel no parece ser central porque su carencia no inhibe la activación del promotor, sugiriendo que existen otros factores que también se le unen.
Otras regiones implicadas en la activación del promotor se encuentran cercanas a la MLTF; son las de las secuencias CAAT y TATA (dominios de unión), ambas en upstream. Otra región, en downstream (+85 y +120) respecto al sitio de iniciación, también contribuye y contiene dominios de unión para al menos dos factores que pueden cooperar con los de unión a MLTF. Uno de ellos se codifica en el gen IVa2, el cual es inhibido específicamente por el producto de un gen temprano para que se exprese únicamente durante la fase tardía.
La acumulación de mRNAs tardíos no solamente precisa de la activación del promotor, también depende del paso de la polimerasa por la unidad de 29,000 pb. Una terminación prematura del proceso puede darse en dos posiciones diferentes dentro de la unidad. Durante la fase tardía, un 80% de las cadenas de RNA terminan al haberse elongado únicamente 500 nucleótidos; ello no ocurre en momentos tempranos, pero sí la segunda posibilidad de terminación ocurre entonces para impedir una transcripción de mRNAs tardíos en momentos no adecuados. En esta segunda posibilidad, las moléculas de polimerasa no transcriben después del final de la región L2, mediante un sistema que se desconoce. Entre otras posibilidades, podría deberse al cambio tipo cis-acting que sufre la cromatina.
A esta altura de la replicación el transporte de mRNAs de la célula huésped hacia el núcleo se ve bloqueado mediante un complejo proteíco constituido por los polipéptidos E1B-55 kd y E4-34 kd. Este complejo mimetiza a un spliceosoma al unirse a los transcritos primarios no víricos. El mismo complejo es requerido para darse una acumulación de mRNAs tardíos víricos en el citoplasma. E1A-55kd también se une a p53, aunque no existen evidencias de que este gen supresor de tumor esté implicado en el bloqueo del transporte.
La discriminación entre los mRNAs del huésped y los virales no se basa en diferencias de identidad de los mRNAs individuales. Genes celulares provenientes de cromosomas recombinantes virales producen mRNAs que son transportados a citoplasma como si se tratase de genes virales. Un modelo sugerido explicaría por qué la inhibición del transporte de los mRNAs huésped es simultánea a la activación del transporte de los virales, aunque no ha sido demostrado. Se trataría de que E1B-E4 localizaría un factor encargado del transporte de los mRNAs desde el lugar de síntesis hacia los complejos del poro nucleares y lo llevaría hacia los núcleos de transcripción de los genomas virales, dejando a los núcleos de la célula huésped sin factor de transporte. En adición a este proceso, los mRNAs virales son también trasladados con preferencia una vez llegan al citoplasma. Uno de los factores responsables de este hecho comprende a la proteína quinasa celular R (PKR), activada por los RNAs virales de cadena doble que se acumulan en gran cantidad en la célula huésped. Tras ser activada, puede fosforilar eIF-2alfa, inactivando así el factor de iniciación y bloqueando el traslado de los mRNAs huéspedes. La protección de los mRNAs virales reside en unas partículas pequeñas de RNAs codificadas en el gen viral VA y se media por la compartimentación diferencial entre mRNAs huéspedes y virales.
La inactivación de eIF-4F también contribuye a el traslado selectivo dentro de las células infectadas por adenovirus. Este factor de iniciación se une a la porción cap de los mRNAs celulares y facilita la iniciación de la traducción. eIF-4F es normalmente activado por fosforilación y se inactiva durante la fase tardía de la infección, cuando los mRNAs celulares no son trasladados al citoplasma.
Las 5 familias de mRNAs adenovirales contienen una secuencia en 5’ de 200 nucleótidos no codificadora (tripartite leader sequence), la cual es importante para el traslado de los mRNAs virales durante la fase tardía de la infección.
Finalmente, se da una activación selectiva de la síntesis proteica viral por una proteína de 100 kd de la familia L4 de los mRNAs tardíos. Parece ser que esta proteína se une a los mRNAs, sugiriéndose que quizás intervenga en los polisomas para facilitar la traducción viral.
Cuando se da una infección latente, la síntesis macromolecular de la célula huésped cesa durante la fase temprana, pero permanece intacta y no es lisada; en esta situación las partículas de adenovirus tienden a acumularse en el citoplasma formando cuerpos de inclusión visibles por microscopio electrónico como cristales eosinofílicos. La reactivación es causada por lisis accidental de las células infectadas, surgiendo así las partículas víricas del núcleo y generando una eficiente reinfección.
ENCAPSIDACIÓN Y SALIDA DE LA CÉLULA HUÉSPED
Los trímeros de hexámeros son rápidamente unidos a los monómeros tras su síntesis en el citoplasma. La misma proteína L4-100 kd media esta unión, actuando como un esqueleto sobre el cual pueda darse el proceso, aunque el mecanismo se desconoce. Los pentámeros son ensamblados más lentamente en el citoplasma con la fibra trimérica. Los experimentos indican que el pentámero y la fibra se ensamblan primero de manera independiente para luego unirse y formar entonces un capsómero completo. Después de ser producidos, los capsómeros son acumulados en el núcleo, lugar en donde se realizará la encapsidación.
Alteraciones de las proteínas estructurales pueden afectar a la eficiencia del proceso, el cual comienza por la formación de una cápside vacía y finaliza con la introducción de la respectiva molécula de DNA. El reconocimiento DNA-cápside es mediado por la secuencia empaquetadora tipo cis-acting, centrada a unas 260 pb del lado izquierdo del cromosoma viral. Presumiblemente, una o más proteínas se unen a esta secuencia y median la interacción entre el DNA y la cápside, aunque no han sido identificadas. Este elemento regulador solamente actúa cuando está cerca del final del cromosoma, lo que sugiere que quizás intervengan en el proceso las proteínas que interactúan con el origen final de replicación. La encapsidación no es un proceso que se de espontáneamente en ausencia de un DNA capaz de interactuar. El proceso es polar, entrando en primer lugar el final izquierdo del cromosma viral mediante un mecanismo bajo controversia, ya que algunos autores sugieren que el proceso de encapsidación se da simultáneamente al proceso de replicación, mientras que otros defienden que ocurren de manera independiente.
La proteína 52/55 kd codificada en L, con dos formas fosforiladas diferenciales, facilita el proceso de encapsidación. Actúa como un soporte sobre el cual darse el proceso y no aparece en las partículas víricas maduras. Otra proteína, una cisteína proteinasa codificada en L3 que requiere fragmentos de DNA de otro polipéptido viral como cofactores y actúa tardíamente en el proceso. Es cortada en al menos 4 constituentes del virión, los llamados VI, VII y VIII y proteínas terminales, que estabilizan la estructura de la partícula, confiriéndole la capacidad de ser infecciosa.
Parece ser que existen al menos dos mecanismos virales mediante los cuales la salida de las partículas víricas hacia el exterior celular es facilitada. Ambos incluyen degradación de los filamentos intermedios del citoesqueleto celular. Tras el proceso de adsorción, y sin requerir expresión genética viral, el sistema de vimentina comienza a colapsarse en respuesta al factor E1B-19 kd, resultando en un colapsamiento total en la región perinuclear. Más tarde en la infección, unas proteinasas víricas impiden la polimerización de los filamentos de citoqueratina al desproveerlos de una parte de su secuencia de aminoácidos. Todo ello hace a la célula más vulnerable a la lisis y, por tanto, facilita la salida de la progenie vírica.
INTERACCIONES CON EL HUÉSPED
Los adenovirus pueden mantener interacciones largas con sus huéspedes humanos, llegando a persistir durante años tras la infección inicial. DNA adenovírico ha sido identificado mediante hibridación in situ en linfocitos de individuos aparentemente sanos. Los linfocitos son las células en donde buscar adenovirus infectando los ganglios linfoides.
Los virus contienen 3 proteínas que facilitan la persistencia antagonizando las respuestas antivirales provenientes del organismo: proteínas E1A, los RNAs de VA y los productos de la región L3. Los dos primeros inhiben la respuesta celular a los interferones alfa y beta; los últimos protegen a las células infectadas de la lisis por linfocitos T citotóxicos y el factor de necrosis tumoral. Es importante el hecho de que precisamente los factores que median la persistencia celular se codifiquen en los 3 genes que más se encuentran activos en los adenovirus que infectan linfocitos. Los dos primeros se encuentran activos constitutivamente y los productos de L3 son únicos dentro de los adenovirus porque pueden unirse al factor de transcripción de linfocitos NFkappaB, facilitando así su expresión constitutiva.
Además, parece ser que estos genes pueden ser inducidos por interleucina-6, una citoquina que es precisamente producida por el organismo en los lugares de infección por adenovirus. La transcripción del gen E2 es activada fuertemente por IL-6 a través del factor de transcripción celular NFL-IL6; la proteína resultante tiene la capacidad de activar los promotores de los genes E1A y E3. De esta manera, la producción de una citoquina por el huésped se traduce en una respuesta protectora para las células infectadas en vez de ayudar a destruirlas.
Las proteínas adenovirales E1A y RNAs asociados a los virus protegen de los interferones alfa y beta:
E1A inhibe el efecto antiviral del interferón bloqueando la activación de los genes de respuesta a interferón; esto resulta de la inhibición de la actividad de unión al DNA del ISGF3, un factor de transcripción celular activado por la unión del interferón alfa o beta a la membrana celular. Esta función de E1A se realiza mediante su dominio CR1, quién también se unía a p53 y a miembros de la familia de pRB.
Los RNAs pequeños y abundantes codificados en el gen VA tienen una longitud de unos 160 nucleótidos y son varias especies ricas en GC; adoptan estructuras secundarias estables, importantes para su función, y son transcritos por la RNA polimerasa III durante la fase temprana de la infección, para incrementarse drásticamente durante la fase tardía.
eIF-2 pertenece a uno de los caminos centrales en el control del proceso de traducción. Se une a GTP al principio del proceso de iniciación y al iniciador de tRNA para formar un complejo ternario que interactúa con la subunidad 40s del ribosoma. Cuando el mRNA se ha unido a todo el complejo, que incluye también a la subunidad 60s ribosomal, eIF-2 se escinde portando GDP, que tendrá que sustituir por un nuevo GTP para participar en una nueva ronda de iniciación. La reacción de cambio de GDP por GTP se media por la proteína eIF-2B, pero si eIF-2 es fosforilado, la reacción es inhibida, resultando en una reducción de la traducción. La fosforilación de eIF-2 se produce por una proteína quinasa R (PKR). Los interferones actúan induciendo la síntesis de PKR inactiva, que luego se activa por la unión de dos moléculas a ds RNA (una a cada cadena). Los RNAs de VA se unen a PKR, bloqueándola e impidiendo su acción y antagonizando así el efecto antiviral del interferón.
Los adenovirus también pueden antagonizar los efectos del factor de necrosis tumoral (TNF-alfa), IL-1 e IL-6, frecuentes en los tejidos infectados seguidos de la infiltración de linfocitos T citotóxicos en la zona. Los productos genéticos de E3, no necesarios para el crecimiento eficiente viral, combaten estos factores, inhibiendo la lisis de las células infectadas.
Para darse la lisis de células infectadas, éstas han de presentar epítopos antigénicos del virus en su superficie a los linfocitos mediante el complejo principal de histocompatibilidad de clase I (MHC I). El polipéptido codificado en E3 (19kd) es considerablemente menos sensible a la lisis que otros. Reside en forma transmembrana en el retículo endoplásmico; cuando se une a MHC I resulta en su retención en el retículo, impidiendo su traslado hacia la superficie celular.
TNF-alfa es una citoquina secretada por macrófagos y linfocitos activados. Puede inducir la lisis de células tumorales e infectadas por virus. Mientras que las proteínas E3-14.7 kd y E4-10.4 kd antagonizan la acción de TNF-alfa, la región CR1 de E1A es responsable, por el contrario, de inducir sensibilidad a este factor; aunque es cierto que los virus salvajes no se ven afectados por TNF-alfa. E3-14.7 kd inhibe el incremento de ácido araquidónico provocado por la activación de la fosfolipasa 2 a través de TNF-alfa.
E1B-19 kd puede bloquear apoptosis y citolisis inducidas por TNF-alfa
Así los adenovirus contienen tres proteínas antagonizadoras de TNF-alfa:
La razón de cargar con tres mecanismos aparentemente redundantes se especula como un mecanismo de asegurar su acción, ya que cada vía puede funcionar con diferente eficiencia en diferentes tipos celulares; alternativamente, podría ser que cada una realizara una función parcial, convergiendo todas las funciones en el resultado antagonizador de TNF-alfa (lo cual indicaría que además de éstas, tienen otras funciones no relacionadas). El último parece ser el caso de E3-10.4 kd, quien además reduce el nivel de receptores celulares para el factor de crecimiento epidérmico. Esta proteína contiene un dominio muy similar a la secuencia del factor de crecimiento epidérmico, lo que indica que quizás esa reducción esté reflejando la activación del receptor en el interior celular, con lo cual E3-10.4 kd estaría ayudando a activar a las células quiescentes a través de la vía de respuesta al factor de crecimiento epidérmico. Aunque los motivos reales de esta reducción de receptores no están aclarados.
INTERACCIONES CON OTROS VIRUS
Los adenovirus son capaces de interactuar con otros virus, como Parvovirus defectivos (virus Adeno-asociados). SV40 (Papovavirus) es conocido como virus helper para adenovirus, ya que la coinfección permite desbloquear la fase tardía para infectar eficientemente así a células que en principio son resitentes a los adenovirus. Este proceso podría involucrar la sustitución del antígeno T de SV40 por el Ad DBP. Se han podido aislar híbridos Adeno-SV40 tras la infección de células con adenovirus mutantes defectivos en gran presencia de SV40; esto indica un solapamiento funcional entre las dos familias.
TERAPIAS CONTRA ADENOVIRUS
Apenas existen terapias contra las infecciones causadas por adenovirus. En algunos países se han usado vacunas de virus inactivado (por ejemplo en Estados Unidos) para tratar a personas relacionadas estrechamente con factores de riesgo para contraer infecciones respiratorias; el riesgo para la población en general es reducido y la vacunación no es una proposición viable.
En los últimos años, ha habido un considerable interés en el desarrollo de adenovirus como vectores defectivos portadores de genes extraños con fines terapéuticos.