3. Tipos de clonación[1]
Tipos de clonación según el método
1. Partición (fisión) de embriones tempranos: analogía con la gemelación natural. Los individuos son muy semejantes entre sí, pero diferentes a sus padres. Es preferible emplear la expresión gemelación artificial, y no debe considerarse como clonación en sentido estricto.
2. Paraclonación: transferencia de núcleos procedentes de blastómeros embrionarios o de células fetales en cultivo a óvulos no fecundados enucleados y a veces, a zigotos enucleados. El “progenitor” de los clones es el embrión o feto.
3. Clonación verdadera: transferencia de núcleos de células de individuos ya nacidos a óvulos o zigotos enucleados. Se originan individuos casi idénticos entre sí (salvo mutaciones somáticas) y muy parecidos al donante (del que se diferencian en mutaciones somáticas y en el genoma mitocondrial, que procede del óvulo receptor).
3.1 Gemelación artificial[2][10]
Partición de un embrión, o separación de blastómeros en embriones preimplantatorios (de 2-32 células). Cada mitad o trozo desgajado del embrión se introduce en una zona pelúcida de otro óvulo, o en una cubierta artificial (ZPA), y se implanta.
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Embriones se mojan en 1% de alginato y se transfieren a medio con Cl2Ca, que induce la polimerización. |
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En ratones, tiene éxito con blastómeros separados en fase de 2 células. Pero los blastómeros de embriones de 4-8 células pueden suministrar células para la masa celular interna y para el trofectodermo si se incorporan junto con blastómeros de otros embriones. |
Se viene aplicando desde hace años en ganadería. Estudios de Willadsen (1979 y 1981) sobre ovejas: algunos blastómeros de embriones de 4-8 células pueden originar individuos completos.
Recientemente se ha hecho en monos (macacos Rhesus)[3][11]
En humanos hubo un experimento polémico (Hall y Stillman, 1993) con un zigoto poliploide inviable (no se pretendía implantarlo). Más estudios del equipo de Paul Gindoff de la Universidad G. Washington con embriones anómalos: los embriones más tempranos son mejores para la separación de blastómeros. La ZP natural se disgrega con pronasa y se colocan los embriones en Ca para separar los blastómeros. Inclusión de blastómeros en ZPA de alginato. La capacidad de división de los blastómeros de fases de 2 células era de 3 divisiones, y disminuía con blastómeros más tardíos.
El resultado son individuos prácticamente idénticos entre sí (salvo mutaciones somáticas), pero diferentes a sus padres. Serían equivalentes a gemelos monozigóticos.
No se debe considerar como clonación en sentido estricto.
3.2 Paraclonación: por transferencia de núcleos de células embrionarias o fetales
Los núcleos pueden proceder de:
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Blastómeros de embrión preimplantatorio: las células de la masa celular interna como las del trofectodermo son totipotentes. |
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Células embrionarias o fetales de un cultivo primario o de un cultivo celular. |
Estos núcleos se transfieren a un óvulo enucleado o a un zigoto al que se le hayan eliminado los pronúcleos. Este óvulo receptor aporta mitocondrias, y en el caso del zigoto, algo del espermatozoide.
El resultado: individuos casi idénticos entre sí, pero diferentes de los progenitores del embrión que aportó el núcleo transferido. Se pierde una generación, ya que el embrión donante del núcleo se destruye. Los individuos nacidos así se parecerían (desde el punto de vista del genoma nuclear) al individuo que hubiera surgido del embrión destruido.
A mitad de los 80 se venían produciendo paraclonaciones en diversos animales de granja: ovejas y vacas.[4][12] Willadsen logró terneros por transferencia de núcleos de embriones en fase de hasta 128 células. En 1996 el equipo de Wilmut y Campbell logró dos ovejas (Megan y Morag) por transferencia de núcleos de embriones. PPL siguió con experimentos de paraclonación con células embrionarias y fibroblastos fetales.[5][13]
Se ha descrito igualmente la producción de monos Rhesus por transferencia de núcleos de blastómeros[6][14].En un caso se dividieron 107 embriones en 368 unidades, lográndose 4 embarazos, de uno de los cuales nació Tetra. [7][15] Alguno de los intentos condujo a embarazos “ciegos”, consistentes en un saco placentario desprovisto de tejido fetal. En una postdata los autores anuncian que acaban de lograr 4 embarazos, cada uno con un feto viable, a partir de los últimos 7 embriones originados por separación de blastómeros. Dos de los fetos son gemelos idénticos por fisión de un embrión original. Nacieron vivos y se llaman Neti y Ditto.
Se ha empleado en animales transgénicos clónicos. Polly (julio 1997), de PPL, es una oveja paraclónica (núcleo donante: fibroblastos fetales) transgénica productora de factor IX de coagulación humano[8][16]. Intentos de cerdos modificados para xenotrasplantes.
Un avance reciente significativo es la clonación de decenas de ratones empleando núcleos de células madre no quiescentes, realizado por un equipo de la Universidad de Hawai y la Universidad Rockefeller[9][17]. Una de las mayores incidencias de este trabajo es que demuestra que se puede clonar con núcleos de células en cultivo bien caracterizadas, y no solamente con células frescas o cultivos primarios. Como las células madre de ratón se manejan bien desde el punto de vista genético, esto abre la vía a la fácil creación de ratones clónicos y transgénicos.
3.3 Clonación (en sentido estricto): por transferencia de núcleos de células de individuos nacidos.
El núcleo procede de individuo nacido. Se transfiere a óvulo o zigoto enucleados, y el embrión se implanta en útero. El resultado: individuos casi idénticos entre sí y casi idénticos a su progenitor (donante del núcleo).
Se ha logrado en varias especies[10][18]:
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Oveja (Dolly). Núcleo donante de célula sin identificar de ubre de oveja de 6 años de la raza Finn Dorset. Embrión implantado en hembra Scottish Blackface. Baja tasa de éxitos: 430 óvulos, de los que se obtuvieron 277 óvulos reconstituidos, que se cultivaron por separado durante 6 días. 29 blastocistos “normales” se transfirieron a hembras receptoras. El único éxito fue Dolly. Algunos fueron fetos o neonatos muertos, o con alteraciones del desarrollo. |
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Ratones, con núcleos del cúmulo oóforo[11][19]. (El primer ratón clónico nació el 3 de octubre de 1997, y fue llamado Cumulina; ya ha tenido progenie aparentemente normal, que a su vez se ha reproducido). El haber obtenido clones en esta especie de laboratorio, con ciclo de vida corto y de la que se tienen amplios conocimientos de su genética, abre perspectivas insospechadas para los estudios básicos sobre la clonación: mecanismos de la reprogramación celular, impronta (imprinting) genómica, activación del genoma del embrión, diferenciación celular, etc. Poco después, este mismo equipo japonés informó de la clonación de ratones a partir de células del rabo de ratones adultos.[12][20] |
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Ganado bovino: núcleos de células epiteliales del oviducto, del cúmulo oóforo, [13][21] epiteliales, musculares. |
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Ganado caprino. |
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Recientemente se ha logrado en ganado porcino: el grupo de Roslin-PPL lo ha conseguido con un nuevo método de doble transferencia nuclear, con el nacimiento de cinco lechones, con dos subgrupos de tres y dos que eran clones entre sí y con respecto al correspondiente donante. Sus nombres: Millie, Christa, Alexis, Carrel y Dotcom. (I.A. Polejaeva et al. [2000]: “Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells”, Nature 407: 86-90). |
¿Un protocolo universal para clonación reproductiva?
El grupo de Wakayama, en el artículo reciente que informa sobre clonación de ratones a partir de núcleos de células madre, propone un posible esquema que permitiría la clonación ilimitada a partir de casi cualquier célula del organismo (al menos en esta especie)[14][22]:
1. Transferencia por microinyección de un núcleo de célula somática a un óvulo enucleado.
2. Se dejaría desarrollar el embrión in vitro hasta una fase previa a la de implantación.
3. A partir de las células de la masa interna del blastocisto se pueden establecer cultivos estables (inmortales) de células madre (ES). Todas esas células contendrían el mismo genoma nuclear que el individuo donante, genoma que quedaría de esta forma “inmortalizado”.
4. Las células madre pueden servir a su vez para:
a. Terapias celulares
b. Clonación reproductiva
c. Manipulación genética: se podrían generar ratones mutantes, incluso en homozigosis, en una sola generación, sin pasar por la generación intermedia de quimeras. Ello permitiría analizar las funciones complejas que dependen de varios genes.
d. Combinación de b) y c) para producir individuos clónicos transgénicos.
