Teknik ‘Blotting’ merupakan teknik untuk proses pemindahan RNA, DNA atau protein kepada membran yang stabil contohnya membran ‘nitrocellulose’. Kaedah ini biasanya dilakukan untuk memindahkan protein kepada nitrocellulose sepertimana yang telah diterangkan oleh Towbin et al pada 1979. terdapat banyak teknik elektroblotting namun teknik pemindahan dengan cara kering /’wet’, adalah yang biasa digunakan daripada teknik yang lain. Protein pada mulanya diasingkan dengan menggunakan SDS-PAGE, kemudian gel tersebut dipindahkan daripada kaset elektroforesis dan diseimbangkan dengan ‘transfer buffer’ dengan metanol. Pada pH larutan tampan (pH 8.3), kebanyakan protein adalah bercas negatif dan akan bergerak ke anod ( elektrod positif ).Selepas pemindahan dilakukan, membran tersebut diwarnakan dengan Coomassie Blue R-250 dan nyahwarna untuk mengesan lokasi ‘band’ protein. Kemudian, berat molekul subunit polipeptida boleh dikira secara langsung dengan membuat graf ‘semilog’ berat molekul melawan jarak pergerakan protein.
(http://www.biotech.iastate.edu/facilities/protein/sdspage.html)
1) Menganalisis protein campuran dengan cara pemindahan protein daripada gel kepada kertas nitroselulusa menggunakan kaedah ‘electroblotting’.
2) Membuat perbandingan ke atas campuran protein berdasarkan hasil keputusan yang bergantung kepada berat molekul
3) Mengenalpasti protein yang antigenik terdapat pada protein melalui tidakbalas antigen-antibodi yang dapat dilihat dengan menggunakan substrat DAB.
4) Mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi keputusan ujian serta masalah-masalah yang sering berlaku semasa Western blot dan mengatahui cara-cara untuk menyelesaikan masalah yang berlaku.
1) Penyediaan gel SDS-PAGE telah siap disediakan untuk setiap kumpulan. Gel tersebut kemudiannya dimasukkan ke dalam bekas yang mengandungi larutan kerja .
2) Kemudian setiap kolam pada gel tersebut dibasuhkan dengan air suling.
3) Setiap kumpulan akan diberikan :
10ul Molecular weight marker
70ul protein staphylococcus aureus
4) Gel SDS-PAGE ini disediakan hanya terdapat 3 kolam sahaja . Rujuk gambar lampiran 1.
5) Pada kolam yang pertama sebanyak 5ul MWM dimasukkan menggunakan syringe.
6) Selepas itu, protein dimasukkan ke dalam klam kedua dan untuk kolam ketiga ialah 5ul LMW marker.
7) Bekas yang mengandungi larutan kerja ditutup dan disambungkan kepada kuasa elektrik pada 30mA selama 45 minit atau sehingga terdapat warna /dye kelihatan 1 cm menghampiri pada plat kaca tersebut. Setelah itu, suis elektrik dimatikan untk menamatkan proses penyebaran.
1) Semasa hendak melakukan proses ini pelajar dikehendaki menggunakan sarung tangan / ‘gloves’ bagi mengelakkan kecederaan semasa mengendalikan proses ini.
2) Plat kaca sandwich dikeluarkan daripada gel SDS-PAGE dengan berhati-hati menggunakan spatula sebagai pemisah bahagian.Gel akan dipotong pada penghujung kiri bawah untuk memastikan arah pergerakan protein tersebut. Dengan menandakan dengan ‘A’. Dengan menggunakan dakwat india yang telah disediakan , dakwat india ini diwarnakan ke atas garisan ‘tracker dye’. Selepas itu hujung pada bahagian B dipotong menggunakan spatula ( lihat gambar ) dan kemudiannya diwarnakan dengan pewarna Coomassie Blue selama 30 minit.
3) Sebelum itu ‘stacking gel’ dipotong dengan baik supaya bentuk gel yang dihasilkan adalah elok.
4) Setelah itu, gel A akan dimasukkan ke dalam bekas yang mengandungi larutan penampan seimbang / ‘equilibration buffer’dan gel tersebut direndamkan dalam diletakkan di atas alat penggoncang / ‘belly dancer’ selama 1 jam.
5) Setiap kumpulan akan diberikan satu kertas nirtocellulose ( NC ), 2 scotch brite pad, dan 4 helai kertas turas yang telah direndamkan dalam bekas yang mengadungi transfer buffer.
6) Kertas penuras dan membran NC dipastikan kering.
7) Kaset pemindahan dibuka dengan warna hitam beradan dibawah sekali. Dan penyusunan kaset daripada hitam kepada putih dilakukan mengikut susunan iaitu dengan merujuk kepada lampiran 2.
8) Selepas itu, kaset ditutup dan diletakkan ke dalam bekas yang mengandungi ‘transfer buffer’/ larutan kerja pemindah dan ditutup serta dialirkan elektrik pada 0.25A selama 1 jam.
1) Pada akhir proses pemindahan /‘electroblotting’, kaset diambil dan diletakkan secara terbalik iaitu bahagian kaset yang berwarna putih diletakkan di atas meja.
2) Kaset dibuka dan pita scotch brite pad serta kertas turas dikeluarkan tetapi gel tidak dikeluarkan seperti pita dan kerta turas tersebut. Dengan menggunakan pen, kertas NC ditandakan untuk megetahui arah hadapan pemindahan protein. Ini diikuti dengan dakwat india diplotkan sepanjang ‘tracker dye’ yang telah terbentuk.
3) Kemudian gel dipisahkan dan diwarnakan dengan pewarna Coomassie selama 30 minit dan nyahwarna untuk mengetahui bahawa pemindahan protein yang dilakukan adalah berhasil dan jelas kelihatan.
4) Kertas NC tersebut digariskan pada hujung tracker dye menggunakan pen.
5) Setelah itu, kertas NC tersebut diwarnakan dengan Ponceau S yang telah diberikan selama 2-5 minit.
6) Kemudian kertas tersebut dibasuh menggunakan TBS untuk membuang lebihan warna merah dan nyahwarna dilakukan untuk menanggalkan warna Ponceau S pada kertas tersebut.
7) Setelah itu, bahagian yang mengandungi LMW akan dipotong dan disimpan sebagai rujukan.
8) Kertas yang tidak dipotong tersebut diserahkan kepada pengajar supaya proses pemotongan dibuat untuk setiap pelajar.
1) Kertas yang telah siap dipotong oleh pengajar diberikan kepada pelajar semula, dan setiap satu strip tersebut akan diambil oleh seorang pelajar.
2) Kemudian strip tersebut akan diletakkan ke dalam bekas ‘blok’ yang disediakan.
3) Strip tersebut diisikan dengan 1 ml susu di’blok’kan pada kertas srtip tersebut selama 30 minit dan ianya digoncangkan menggunakan alat ‘belly dencer’.
4) Setelah itu susu tersebut dikeluarkan dengan menggunakan pipet dan kemudiannya dibasuh dengan 1 ml TBS selama 5 minit sebanyak 3 kali basuhan.
5) Seterusnya, sebanyak 1ml antibodi primer/ anti kanamycin gene protein antibody dimasukkan kedalah bekas ‘blok’ tersebut dan dieramkan selama 1 jam / semalaman..
6) Setelah tamat tempoh pengeraman semalaman, strip tersebut dibilas menggunakan TBS sebanyak 6 kali dalam masa 30 minit.
7) Kemudian sebanyak 1 ml antibodi kedua/ anti-mouse IgG HRP 1:100 dimasukkan dan dibiarkan selama sejam pada suhu bilik.
8) Apabila tamat sejam, strip tersebut diwarnakan dengan substrat DAB yang kemudiannya dibalut dengan kertas aluminium dan digoncangkan selama 15 minit. Tindakbalas dihentikan dengan megeluarkan pewarna tersebut dan dibilas dengan menggunakan air suling.
9) Jalur protein yang antigenik akan kelihatan dan jalur tersebut akan dibuat perbezaan pada gel sebenar yang telah diwarnakan dengan Ponceau S. Bilangan jalur yang terhasil ini dikenalpasti dan diukur jarak pergerakannya.
1.SDS-PAGE
Pengiraan untuk mengetahui petunjuk berat molekul dengan menggunakan Pewarna Ponceau S yang menpunyai kedua-dua petunjuk berat molekul dan kedudukan Protien adalah :
Rf = jarak yang dilalui oleh protien_(cm)____
jarak yang dilalui oleh dye petunjuk (cm)
|
Penanda berat molekul KD |
Jarak pergerakan protein (cm) |
Rf |
|
94 |
0.8 |
0.145 |
|
67 |
1.2 |
0.218 |
|
43 |
2.0 |
0.364 |
|
30 |
3.0 |
0.545 |
|
20.1 |
4.2 |
0.764 |
|
14.4 |
5.3 |
0.964 |
|
Jarak dilalui hingga ‘tracker dye’ |
5.5 |
|
2. WESTERN BLOT
|
Jalur protein |
Jarak yang dilalui oleh protein (cm) |
Rf |
|
1 |
0.4 |
0.073 |
|
2 |
0.6 |
0.109 |
|
3 |
0.8 |
0.145 |
|
4 |
1.8 |
0.327 |
|
5 |
2.6 |
0.472 |
|
6 |
2.7 |
0.49 |
|
7 |
3.9 |
0.709 |
|
8 |
4.0 |
0.727 |
|
9 |
4.7 |
0.854 |
|
10 |
5.0 |
0.909 |
|
11 |
5.2 |
0.945 |
|
12 |
5.4 |
0.981 |
Kemudian kedua-dua keputusan ini, graf berat molekul protein melawan Rf diplotkan.
