Foretay Didier, ECVLLM, juin-novembre 1997
Responsables: Dr. M. Jotterand, PD et Dr. D. Mühlematter, Unité de cytogénétique du cancer, division autonome de génétique médicale, CHUV, Lausanne, Suisse.
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Remerciements:
Je tiens à remercier le Docteur Martine Jotterand qui m'a permis d'effectuer ce travail dans des conditions optimales.
Je remercie également le Docteur Dominique Mühlematter pour sa disponibilité, sa patience et son aide à la rédaction de ce travail.
Je remercie Danielle, Sandrine et Chantal pour leur aide, pour m'avoir initié aux techniques FISH et pour m'avoir permis de travailler dans une très bonne ambiance.
Les leucémies aiguës résultent de la prolifération clonale d'un précurseur hématopoïétique générant des cellules blastiques leucémiques capables de se diviser mais ayant perdu la capacité de se différencier. Cette prolifération a pour conséquence une défaillance médullaire.
Deux groupes de symptômes peuvent être différenciés: ceux causés par une défaillance médullaire et ceux causés par des infiltrations d'organes. La défaillance médullaire provoque une anémie (pâleur, faiblesse,…), une leucopénie (fièvre, infections) et une thrombopénie (diathèse hémorragique). Les infiltrations d'organes peuvent provoquer des douleurs osseuses, des splénomégalies, des hépatomégalies, une hypertrophie gingivale ou une infiltration méningée. Toutefois, ces symptômes d'infiltrations ne concernent que rarement la leucémie myéloblastique aiguë, type M2 (class. FAB) (LMA-M2), qui fait l'objet de ce travail.
Le diagnostic d'une leucémie aiguë peut être posé si on trouve plus de 30% de cellules blastiques dans la moelle osseuse, si ces blastes représentent plus de 30% des cellules médullaires non érythroïdes en cas de prédominance de cellules érythropoïétiques (plus de 50% d'érythroblastes), ou si on trouve des cellules leucémiques promyélocytaires hypergranulaires. Les leucémies myéloblastiques aiguës (LMA) se caractérisent par la présence de bâtonnets d'Auer dans les blastes d'une LMA et par l'expression de la myélopéroxydase (plus de 3% de cellules positives).
La LMA sur laquelle porte ce travail, la LMA-M2, est une leucémie myéloblastique aiguë avec différenciation. Au laboratoire, elle est diagnostiquée de la manière suivante:
La t(8;21)(q22;q22) a été décrite pour la première fois par Rowley, en 1973. Cette translocation semble être plus fréquente chez les jeunes gens et devient rare chez les personnes de plus de 50 ans. C'est l'anomalie structurale la plus fréquente dans les LMA, se trouvant chez 15% de tous les cas et chez 40% des patients atteints de LMA-M2.
Bien que cette translocation soit associée à la LMA-M2, elle a été également observée dans d'autres sous-types de LMA (M1 et M4), ainsi que dans des cas de syndrome myélodysplasique.
Les chromosomes 8 et 21 peuvent prendre part à des réarrangements complexes, impliquant un troisième chromosome. La t(8;21) s’accompagne souvent de la perte d’un chromosome sexuel (le Y chez l'homme et un des X chez la femme). Chez l'adulte, les LMA-M2 avec la t(8;21)(q22;q22) font partie des leucémies aiguës à relativement bon pronostic (bonne réponse à la chimiothérapie standard, taux élevé de rémission et survie en moyenne relativement longue).
Deux gènes sont impliqués dans la t(8;21). Il s’agit, sur le chromosome 21, en position q22, du gène AML-1 et, sur le chromosome 8, en position q22, du gène ETO (Eight Twenty One) ou MTG8 (Myeloid Translocation Gene on 8).
Le gène AML-1 fut découvert par Miyoshi en 1991. Il montre de grandes similitudes avec le gène de segmentation (domaine "runt") de la drosophile et avec la sous-unité alpha de la protéine pebp2 (Polyoma Enhancer Binding Protein). AML-1 code pour la sous-unité alpha du facteur de transcription CBF qui joue un rôle important dans la différenciation hématopoïétique. Il est intéressant de noter que la sous-unité ß de CBF est impliquée dans inv(16)/t(16;16), anomalies observées dans la LMA-M4Eo et qui sont, avec la t(8;21)(q22;q22), les anomalies les plus fréquentes dans les LMA.
Le gène ETO, d’après G. Nucifora et al. (1993), n’a pas d’homologie avec des protéines connues, mais il est caractérisé par deux domaines doigts de zinc (zinc fingers) et plusieurs domaines riches en sérine et en proline. D’après R. Berger (1994), le gène ETO aurait une homologie avec la cycline D2.
Le gène chimérique découlant de cette translocation comprend un intron de 25 kb du gène AML-1 (région 5’, contenant le domaine "runt") et la quasi totalité du gène ETO. Il est situé sur le chromosome der(8) et entraîne la formation d'un transcrit de fusion codant pour un facteur de transcription chimérique.
La connaissance de la séquence de nucléotides de ce gène chimérique a permis de développer des outils moléculaires pour le détecter et par conséquent la translocation t(8;21). Il s’agit du FISH, du Southern blot, de la RT-PCR et de la PCR.
Les préparations utilisées pour ces expériences ont été obtenues à partir de prélèvements de sang normal et d'échantillons de moelle osseuse provenant de patients présentant une LMA. Les lames utilisées pour les expériences ont été préparées à partir de suspensions de cellules fixées dans une solution de méthanol et d'acide acétique (3/1).
On distinguent trois types principaux de sondes:
II.2.1 Caractéristiques des sondes à séquences uniques
La sonde CDR P1 164 a été isolée à partir d'ADN génomique humain (P1, Genome System, St-Louis, MO) et a été obtenue par une réaction de PCR avec une paire d'amorces basées sur la séquence du gène CDR (= ETO). Cette sonde comprend la totalité des séquences codantes du gène CDR et hybride en 8q22.
La sonde cosmide AML-1, ICRF c 103 CO 664, a été identifiée dans une banque de référence du chromosome 21 à l'aide d'un YAC AML-1 de 240 Kb (C4C10) qui enjambe le point de cassure. Le cosmide contient les 5 premiers exons d’AML-1 et hybride en 21q22. (D’après Sacchi et al., 1995)
Le FISH à deux couleurs avec les sondes P1 164 et CO 664 permet de détecter la t(8;21)(q22;q22). Les sondes, spécifiques aux gènes impliqués dans cette anomalie, sont révélés par deux fluorochromes différents (FITC pour P1 164 et Cy3 pour CO 664).
Dans le cas d'une métaphase normale, les sondes P1 164 et CO 664 se situent sur leurs chromosomes cibles (respectivement 8 et 21), en position q22 (cf. figure 1).
Dans le cas de métaphases présentant la t(8;21)(q22;q22), ces sondes permettent la mise en évidence de deux signaux distincts en 8q22 (deux signaux verts) et 21q22 (deux signaux rouges), ainsi que 4 signaux (deux verts et deux rouges) très proches situés sur le chromosome der(8). Ces quatre signaux rapprochés indiquent la présence du gène chimérique AML-1/ETO. Aucun signal n'est trouvé sur le chromosome der(21).
Fig. 1: A. Métaphase et interphase d'un cas normal. B. Métaphase et interphase d'un cas avec la t(8;21)(q22;q22)
II.2.2 Caractéristiques des sondes à séquences multiples
Les sondes pBS 8 et pBS 21 ont été préparées par le clonage de chromosomes 8 et 21, isolés par cytométrie de flux.
Tableau 1: Caractéristiques des sondes pBS 8 et pBS 21.
| Sondes | Banque de phage | Hybridation sur la cible | Hybridations croisées | ||
| bras p | bras q | centro. | |||
| pBS 8 | LL08NS02 | + | + | ++ | ND |
| pBS 21 | LL21NS02 | +, ter-- | + | + | 13cen, 14cen, 15cen, 22cen |
La mise en évidence de la t(8;21)(q22;q22) peut également se faire par painting, à l'aide des sondes permettant la mise en évidence de chromosomes entiers. La sonde pBS 8 donne un très bon painting. Elle est marquée à la digoxygénine et est révélée par le système anti-DIG lié au Cy3.
La sonde pBS 21 n'hybride pas la partie terminale du bras court du chromosome 21, mais hybride le centromère des chromosomes acrocentriques (13, 14, 15 et 22). Elle est marquée à la biotine et est révélée par le système avidine liée au FITC.
On peut utiliser simultanément les deux sondes. Cela permet la mise en évidence de la t(8;21)(q22;q22). On obtient alors le painting complet des chromosomes 8 et 21 normaux, respectivement en rouge et en vert; le chromosome der(8) sera rouge, avec, à l'extrémité du bras long, du vert; le chromosome der(21) sera vert, avec, à l'extrémité du bras long, du rouge.
Le principe du marquage par "nick translation" est basé sur l'action de deux enzymes. La DNase I entraîne la formation de coupures haplotomiques (sur un seul brin). La polymérase s'associe aux extrémités 3' des incisions et allonge la chaîne en direction 5'-3' en polymérisant des nucléotides marqués et non marqués tout en excisant devant elle les nucléotides non marqués de l'extrémité 5'. Les sondes sont marquées grâce à l'incorporation de nucléotides couplés à la biotine ou à la digoxygénine.
La dénaturation des sondes et de l'ADN cible est effectué à 70°C-80°C dans un tampon contenant des cations monovalents (SSC) et 50%-70% de formamide. La présence de solvants organiques diminue la stabilité thermique de l'ADN double-brin. Cela permet d'abaisser la température de dénaturation et d'éviter ainsi une détérioration de la morphologie des chromosomes.
L'hybridation est généralement effectuée à 37°C pendant une nuit, mais sa durée peut varier de quelques heures à quelques jours. Avant l'hybridation, les sondes à séquences uniques et multiples nécessitent une incubation avec de l'ADN enrichi en séquences répétitives (ADN Cot-1) qui permet d'éviter une hybridation non spécifique en hybridant les séquences répétitives de la sonde avant sa mise en présence de l'ADN cible. Après l'hybridation, différents lavages sont effectués pour éliminer l'hybridation non spécifique causée par une faible homologie entre la sonde et l'ADN cible.
Les sondes marquées soit à la biotine soit à la digoxygénine sont révélées respectivement soit par l'avidine, soit par un anticorps anti-digoxygénine, les deux couplés à un fluorochrome. Si le signal est trop faible, une amplification peut être effectuée. Pour les sondes marquées à la biotine, l'amplification consiste en une incubation avec un anticorps anti-avidine biotinylé suivie d'une autre incubation avec de l'avidine liée au fluorochrome. Les deux fluorochromes utilisés pour nos expériences sont l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC, vert, lors d'un marquage à la biotine) et un dérivé de la rhodamine, le Cy3 (rouge, lors d'un marquage à la digoxygénine). La contre-coloration est effectuée par un fluorochrome se liant spécifiquement à l'ADN, comme l'iodure de propidium (rouge, contre-colorant du FITC) ou le DAPI (4', 6-diamidine-2'-phénylindole-2HCl, bleu, contre-colorant du Cy3). Finalement, les lames sont regardées au microscope à fluorescence Zeiss Axioplan®, équipé d’un triple filtre (FITC, DAPI et TRITC). Les photos sont prises avec un film Kodak EPJ 320 T® couleur.
Fig. 4: Principe des techniques FISH.
Un protocole de base pour les techniques FISH a été établi au laboratoire. Toutefois, certains paramètres doivent être ajustés pour chaque type de sonde, comme leurs longueurs et concentrations, ainsi que la concentration d'ADN COT-1 humain. De plus, deux différents types de dénaturation de l'ADN cible ont été testés.
III.1.1 Dénaturation de l'ADN cible
Pour dénaturer l'ADN cible, deux méthodes ont été testées: l'une consiste à incuber les lames pendant cinq minutes à 80°C dans l'étuve, après avoir ajouté 100 µl de tampon de dénaturation sous une lamelle, l'autre à tremper directement les lames pendant deux minutes dans le tampon de dénaturation chauffé à 72°C dans un bain-marie.
Après deux expériences et en complément de celles déjà effectuées au laboratoire, nous avons observé que sur les préparation dénaturées par la méthode au bain-marie, les chromosomes et les noyaux avaient l'aspect caractéristique d'une dénaturation trop forte (aspect "gonflé", bords mal définis) et que le bruit de fond était très important. Tous les résultats décrits ci-dessous ont donc été obtenus sur des préparations dénaturées à l'étuve.
III.1.2 Concentration des sondes
Différentes concentrations de sondes P1 164 et CO 664 (2.5, 5 et 10 ng/µl) ont été testées séparément (FISH à une couleur) et simultanément (FISH à deux couleurs).
Lors du FISH à une couleur, les signaux étaient très faibles pour les deux sondes à une concentration de 2.5 ng/µl. A 5 ng/µl, le signal était plus intense pour les deux sondes, sans présenter de différences notables avec une concentration de 10 ng/µl.
Par FISH à deux couleurs, deux concentrations ont été testées (5 et 10 ng/µl). Pour les deux sondes, suivant les expériences, l'intensité du signal était soit équivalente entre les deux concentrations, soit plus forte avec une concentration de 10 ng/µl.
Les expériences décrites ci-dessous ont donc été effectuées avec une concentration de 10 ng/µl pour les deux sondes.
Différentes concentrations ont également été testées, séparément et simultanément, pour les sondes pBS 8 (5 et 10 ng/µl) et pBS 21 (10, 20, 30 et 40 ng/µl).
Une concentration de 5 ng/µl permettait d'obtenir une bonne intensité du signal pour la sonde pBS 8. Pour la sonde pBS 21, par contre, la concentration a dû être augmentée à 30 ng/µl.
III.1.3 Concentration de l'ADN COT-1 humain (cot)
La concentration de l'ADN COT-1 (cot) doit être ajustée pour chaque sonde. Une concentration trop faible entraîne une hybridation non spécifique, alors qu'une concentration trop forte entraîne une diminution de l'intensité du signal.
D'après les résultats obtenus avec d'autres sondes, deux concentration de cot (20x et 50x la quantité de sonde) ont été testées, par FISH à une et deux couleurs. Pour les sondes à séquence unique, l'augmentation de la concentration à 50x diminuait considérablement l'hybridation non spécifique (et dans certains cas la supprimait), sans diminuer l'intensité du signal.
Pour les sondes pBS, par contre, l'hybridation non spécifique était déjà supprimée à une concentration de 20x, alors qu'une concentration de 50x entraînait la diminution de l'intensité du signal spécifique. Les expériences et résultats décrits ci-dessous ont donc été effectués à des concentrations de 50x pour les sondes à séquences uniques et de 20x pour les sondes pBS.
III.1.4 Longueur de la sonde
D’après la littérature (P. Lichter, 1992), la longueur optimale d'une sonde après marquage est de 100 à 500 paires de bases (pb), de préférence entre 150 et 250 pb pour les cosmides (Lichter, 1990). Une sonde trop courte diminue l'intensité du signal, alors qu'une sonde trop longue augmente le bruit de fond. La longueur de la sonde est ajustée en modifiant la concentration de DNase I au cours du marquage.
Pour les sondes P1 164 et CO 664, différentes longueurs n'ont pas été testées, comme les longueurs obtenues (100-500 pb) à une concentration finale de DNase de 0.8 µg/ml donnaient d'excellents résultats.
Fig. 5: Estimation de la longueur les sondes P1 164 (a) et CO 664 (c), à l'aide des marqueurs de taille V (b) et VIII (d) après marquage et migration sur gel d’agarose 2%, coloration au bromure d’éthidium. A une concentration de DNase I de 0.8 µg/ml, la longueur varie entre 100 et 500 pb pour les deux sondes.
Pour les sondes pBS 8 et pBS 21, différentes concentrations de DNase I ont été testées (de 0.05 à 0.4 µg/ml).
Tableau 2: Variations de la longueur des sondes (pb) en fonction de différentes concentrations de DNase I.
| Concentrations de DNase I (µg/ml) | ||||
| Type de sonde | 0.4 | 0.2 | 0.1 | 0.05 |
| pBS 8 | 100-250 | 125-320 | 150-500 | |
| pBS 21 | 125-320 | 150-500 | 150-700 | |
Les meilleurs résultats ont été obtenus avec des concentrations de DNase I de 0.1µg/ml (125-320 pb) pour pBS 8 et de 0.2 µg/ml (150-500 pb) pour pBS 21.
Fig. 6: Variations de la longueur des sondes pBS 8 et pBS 21 en fonction de différentes concentrations de DNase I. (a: 0.2 µg/ml; b: 0.1; c: 0.05; d: 0.4) e: marqueur V f: marqueur VIII.
Fig. 7: Mise en évidence du gène ETO localisé en 8q22 à l'aide la sonde P1 164 (a) et du chromosome 21 entier à l'aide de la sonde pBS 21 (b) après marquage avec de la biotine et révélation par le FITC. Contre-coloration à l'iodure de propidium. Mise en évidence du chromosome 8 entier à l'aide de la sonde pBS 8 (c) après marquage avec de la digoxygénine et révélation par le Cy3. Contre-coloration au DAPI.
III.2.1 Résultats sur les sangs et moelles de contrôle
Dans le but de tester leur efficacité, les sondes P1 164 et CO 664 ont d'abord été testées sur des lames de sang et de moelle osseuse de patients dont les métaphases ne présentaient pas d'anomalies des chromosomes 8 et 21. Les signaux d'hybridation ont été définis de la manière suivante. Un ou deux spots sur le même chromosome ont été considérés comme un signal. En conséquence, les métaphases caractérisées par deux spots sur les deux chromosomes (2/2), deux spots sur un des chromosomes et un seul sur l'autre (2/1), ou un spot sur les deux chromosomes (1/1) ont été considérés comme portant deux signaux. Les métaphases caractérisées par un (1/0) ou deux (2/0) spot(s) sur un seul chromosome ont été considérées comme portant un seul signal. En moyenne, 10% à 15% des métaphases ont été éliminées, ceci étant principalement dû à une absence d'hybridation ou à un bruit de fond important. Les résultats sont présentés dans le tableau 3.
Tableau 3: Proportions de métaphases présentant un ou deux signaux avec les sondes P1 164 et CO 664 sur les sangs et les moelles contrôles.
| Sondes | P1 164 | CO 664 | ||||||||||||||
| Signaux | 2 | 1 | 2 | 1 | ||||||||||||
| Patients | Spots | 2/2 | 2/1 | 2/1 | Total | 2/0 | 1/0 | Total | 2/2 | 2/1 | 2/1 | Total | 2/0 | 1/0 | Total | |
| Exp. | ||||||||||||||||
| sang 1 | F103/2 | 77(77) | a | 18(18) | 4(4) | 99(99) | 1(1) | 0 | 1(1) | 81(81) | 17(17) | 0 | 98(98) | 2(2) | 0 | 2(2) |
| sang 2 | F105/2 | 86(86) | 11(11) | 1(1) | 98(98) | 1(1) | 1(1) | 2(2) | 83(83) | 15(15) | 2(2) | 100(100) | 0 | 0 | 0 | |
| Moyenne | 81(163) | 14(29) | 3(5) | 98(197) | 1(2) | 1(1) | 2(3) | 82(164) | 16(32) | 1(2) | 99(198) | 1(2) | 0 | 1(2) | ||
| 1362/97 | F108/1 | 67(4) | 0 | 17(1) | 84(5) | 16(1) | 0 | 16(1) | 83(5) | 17(1) | 0 | 100(6) | 0 | 0 | 0 | |
| F108/2 | 80(8) | 10(1) | 0 | 90(9) | 10(1) | 0 | 10(1) | 100(10) | 0 | 0 | 100(10) | 0 | 0 | 0 | ||
| Total | 75(12) | 6(1) | 6(1) | 87(14) | 13(2) | 0 | 13(2) | 94(15) | 6(1) | 0 | 100(16) | 0 | 0 | 0 | ||
| 1210/97 | F112/1 | 79(26) | 18(6) | 0 | 97(32) | 3(1) | 0 | 3(1) | 88(29) | 9(3) | 3(1) | 100(33) | 0 | 0 | 0 | |
| F112/2 | 96(23) | 4(1) | 0 | 100(24) | 0 | 0 | 0 | 83(20) | 13(3) | 0 | 96(23) | 4(1) | 0 | 4(1) | ||
| F113/1 | 92(12) | 8(1) | 0 | 100(13) | 0 | 0 | 0 | 85(11) | 8(1) | 0 | 93(12) | 7(1) | 0 | 7(1) | ||
| F113/2 | 89(8) | 11(1) | 0 | 100(9) | 0 | 0 | 0 | 89(8) | 11(1) | 0 | 100(9) | 0 | 0 | 0 | ||
| F114/4 | 90(9) | 0 | 0 | 90(9) | 10(1) | 0 | 10(1) | 70(7) | 30(3) | 0 | 100(10) | 0 | 0 | 0 | ||
| Total | 88(78) | 10(9) | 0 | 98(87) | 2(2) | 0 | 2(2) | 84(75) | 12(11) | 1(1) | 98(87) | 2(2) | 0 | 2(2) | ||
| Moyenne | 86(90) | 10(10) | 1(1) | 97(101) | 3(4) | 0 | 3(4) | 86(90) | 11(12) | 1(1) | 99(103) | 1(2) | 0 | 1(2) | ||
Le nombre de métaphases présentant deux signaux (à un ou deux spots) représente 98% et 99% pour les sangs et 97% et 99% pour les moelles contrôle avec respectivement les sondes P1 164 et CO 664. La proportion de métaphases avec deux spots sur les deux chromosomes (2/2) est plus élevée dans la moelle que dans les sangs, entraînant la situation inverse dans la proportion de métaphases avec 2 spots sur un chromosome et un seul sur l'autre (2/1). Le nombre de métaphases n'est cependant pas assez élevé pour déterminer si cette différence est significative, la proportion de cellules avec 2 spots sur les deux chromosomes variant de 67% à 96% pour P1 164 et de 70% à 100% pour CO 664. Cette variation semble plus particulièrement dépendante d'une variation entre les différentes expériences que d'une variation entre les patients.
Fig. 8: Mise en évidence sur des métaphases normales des gènes ETO, en 8q22, et AML-1, en 21q22, par FISH à deux couleurs à l'aide des sonde P1 164 et CO 664 marquées respectivement avec de la biotine et de la digoxygénine, révélées respectivement par FITC et Cy3. Contre-coloration au DAPI.
L'efficacité de l'hybridation des sondes à séquence unique a également été testée sur des cellules en interphase (Tableau 4). Trois lames de moelles contrôles provenant de trois expériences différentes ont été observées.
Tableau 4: Proportion de cellules en interphase présentant deux signaux pour chacune des sondes P1 164 et CO664.
| Expériences | Nombre de noyaux | |
| (Cas 1210/97) | observés | analysables |
| F113/1 | 100 | 90 |
| F114/4 | 100 | 65 |
| F112/1 | 100 | 85 |
| Total | 300 | 240 |
| Proportion | 80% | |
Les résultats ont montré que la proportion de noyaux présentant deux signaux pour chacune des deux sondes dépendait de la qualité de l'expérience. Sur 300 noyaux, cette proportion représente 80%, mais varie entre 65% et 90% suivant les expériences. La lame 2 (F114/4) présentant une plus faible proportion de noyaux analysables était caractérisée par un bruit de fond élevé pouvant être attribué à une sonde trop longue. De plus, aucun faux positif n'a été détecté.
III.2.2 Résultats sur les moelles de patients avec la t(8;21)(q22;q22)
Les sondes P1 164 et CO 664 ont ensuite été appliquées aux préparations de 5 patients présentant une LMA-M2 associée à une t(8;21)(q22;q22). Les mises sur lames ont été effectuées à partir de suspension cellulaire conservée plusieurs mois à -20°C dans une solution de méthanol et d'acide acétique (3/1). Les métaphases reportées dans le tableau 5 ne représentent que les métaphases analysables. En moyenne, 14% à 22% des métaphases ont été éliminées, ceci étant principalement dû à une absence d'hybridation ou à un bruit de fond important.
Tableau 5: Proportions de métaphases présentant un ou deux signaux avec les sondes P1 164 et CO 664 sur les moelles de patients présentant la t(8;21)(q22;q22).
| Sondes | P1 164 | CO 664 | ||||||||||||||
| Signaux | 2 | 1 | 2 | 1 | ||||||||||||
| Patients | Spots | 2/2 | 2/1 | 1/1 | Total | 2/0 | 1/0 | Total | 2/2 | 2/1 | 1/1 | Total | 2/0 | 1/0 | Total | |
| Exp. | ||||||||||||||||
| 205/96 | F105/3 | 75(6) | a | 13(1) | 0 | 88(7) | 12(1) | 0 | 12(1) | 75(6) | 25(2) | 0 | 100(8) | 0 | 0 | 0 |
| F105/4 | 83(5) | 17(1) | 0 | 100(6) | 0 | 0 | 0 | 83(5) | 17(1) | 0 | 100(6) | 0 | 0 | 0 | ||
| Total | 79(11) | 14(2) | 0 | 93(13) | 7(1) | 0 | 7(1) | 79(11) | 21(3) | 0 | 100(14) | 0 | 0 | 0 | ||
| 1342/96 | F114/1 | 73(8) | 9(1) | 0 | 82(9) | 18(2) | 0 | 18(2) | 82(9) | 18(2) | 0 | 100(11) | 0 | 0 | 0 | |
| F114/2 | 67(4) | 33(2) | 0 | 100(6) | 0 | 0 | 0 | 83(5) | 17(1) | 0 | 100(6) | 0 | 0 | 0 | ||
| Total | 71(12) | 18(3) | 0 | 89(15) | 11(2) | 0 | 11(2) | 82(14) | 18(3) | 0 | 100(17) | 0 | 0 | 0 | ||
| 341/97 | F121/1 | 77(17) | 14(3) | 5(1) | 96(21) | 4(1) | 0 | 4(1) | 86(19) | 14(3) | 0 | 100(22) | 0 | 0 | 0 | |
| F121/2 | 83(15) | 17(3) | 0 | 100(18) | 0 | 0 | 0 | 89(16) | 11(2) | 0 | 100(18) | 0 | 0 | 0 | ||
| F121/3 | 70(16) | 22(5) | 4(1) | 96(22) | 4(1) | 0 | 4(1) | 91(21) | 9(2) | 0 | 100(23) | 0 | 0 | 0 | ||
| Total | 76(48) | 17(11) | 3(2) | 97(61) | 3(2) | 0 | 3(2) | 89(56) | 11(7) | 0 | 100(63) | 0 | 0 | 0 | ||
| 1454/97 | F121/4 | 81(21) | 12(3) | 0 | 93(24) | 7(2) | 0 | 7(2) | 88(23) | 8(2) | 0 | 96(25) | 4(1) | 0 | 4(1) | |
| F121/5 | 87(20) | 13(3) | 0 | 100(23) | 0 | 0 | 0 | 78(18) | 18(4) | 0 | 96(22) | 4(1) | 0 | 4(1) | ||
| F121/6 | 91(20) | 9(2) | 0 | 100(22) | 0 | 0 | 0 | 86(19) | 14(3) | 0 | 100(22) | 0 | 0 | 0 | ||
| F117/1 | 75(9) | 8(1) | 0 | 83(10) | 17(2) | 0 | 17(2) | 67(8) | 33(4) | 0 | 100(12) | 0 | 0 | 0 | ||
| Total | 84(70) | 11(9) | 0 | 95(79) | 5(4) | 0 | 5(4) | 82(68) | 16(13) | 0 | 98(81) | 2(2) | 0 | 2(2) | ||
| 597/96 | F121/7 | 78(14) | 22(4) | 0 | 100(18) | 0 | 0 | 0 | 72(13) | 22(4) | 0 | 94(17) | 6(1) | 0 | 6(1) | |
| F121/8 | 71(15) | 19(4) | 5(1) | 95(20) | 5(1) | 0 | 5(1) | 81(17) | 14(3) | 0 | 95(20) | 5(1) | 0 | 5(1) | ||
| Total | 74(29) | 21(8) | 3(1) | 97(38) | 2(1) | 0 | 2(1) | 77(30) | 18(7) | 0 | 95(37) | 5(2) | 0 | 5(2) | ||
| Moyenne | 79(170) | 15(33) | 1(3) | 95(206) | 5(10) | 0 | 5(10) | 83(179) | 15(33) | 0 | 98(212) | 2(4) | 0 | 2(4) | ||
En moyenne, pour les cinq patients étudiés, 95% et 98% des métaphases, pour respectivement P1 164 et CO 664, présentent deux signaux (à un ou deux spots) sur les deux chromosomes. Par rapport aux moelles contrôles, la proportion de métaphases avec deux spots sur les deux chromosomes (2/2) est plus basse chez ces cinq patients (79% contre 86% pour P1 164 et 83% contre 86% pour CO 664). Cette diminution est corrélée à une nette augmentation dans la proportion de métaphases avec deux spots sur un chromosome et un seul sur l'autre (2/1) (15% contre 10% pour P1 164 et 15% contre 11% pour CO 664). Le nombre de métaphases n'est cependant pas assez élevé pour déterminer si cette différence est significative et si elle pourrait être attribuée au stockage de plusieurs mois dans le fixateur, la proportion de cellules avec 2 spots sur les deux chromosomes variant de 67% à 91% pour P1 164 et CO 664, celle avec 2 spots sur un chromosome et un seul sur l'autre (2/1) variant de 9% à 33% pour P1 164 et de 8% à 33% pour CO 664.
Tableau 6: Comparaison entre les résultats obtenus par cytogénétique conventionnelle et par FISH métaphasique et interphasique dans la détection de t(8;21)(q22;q22).
| Proportion de cellules présentant une t(8;21)(q22;q22) | ||||||||||
| Bandes G | FISH | Proportion | ||||||||
| Patients | Caryotype | Métaphases | Interphases | analysable | ||||||
| 205/96 | 45,X,-Y,t(8;21)(q22;q22) | 100 | [25] | a | 100 | [14] | 94 | [175] | b | 88 |
| 1342/96 | 45,X,-Y,t(8;21)(q22;q22) | 100 | [15] | 100 | [17] | 86 | [72] | 72 | ||
| 341/97 | 46,XY,t(8;21)(q22;q22) [12]/ | 100 | [25] | 90 | [63] | 88 | [174] | 87 | ||
| 46,idem,del(7)(q22q36) [13] | ||||||||||
| 1454/97 | 45,X,-Y,t(8;21)(q22;q22) [9]/ | 90 | [10] | 93 | [83] | 83 | [169] | 85 | ||
| 46,XY [1] | ||||||||||
| 597/96 | 46,XY,t(8;21)(q22;q22) [25]/ | 96 | [27] | 98 | [39] | 91 | [178] | 89 | ||
| 46,idem,t(2;7) [1]/ | ||||||||||
| 46,XY [1, incomplète] | ||||||||||
En comparant les résultats obtenus par FISH métaphasique à ceux de la cytogénétique en bandes G (Tableau 6), on observe que chez deux patients (205/96 et 1342/96), l'analyse FISH a confirmé la présence de 100% de métaphases présentant une t(8;21)(q22;q22). Chez le patient 341/97, le FISH a permis de mettre en évidence la présence de 10% de métaphases ne présentant pas la t(8;21)(q22;q22) qui n'avaient pas été détectées par la cytogénétique conventionnelle. Enfin, chez les patients 1454/97 et 597/96, le FISH a permis de confirmer la présence de métaphases ne présentant pas la t(8;21)(q22;q22), vues par la cytogénétique conventionnelle. Grâce au fait que cette méthode permette d'analyser un plus grand nombre de métaphases, nous avons pu déterminer plus précisément le pourcentage de métaphases négatives, qui est de 7% (contre 10% en cytogénétique conventionnelle) pour le patient 1454/97 et de 2% (4%) pour le patient 597/96.
Fig. 9: Mise en évidence, sur des métaphases présentant la t(8;21)(q22;q22), des gènes ETO, en 8q22, et AML-1, en 21q22, par FISH à deux couleurs à l'aide des sonde P1 164 et CO 664 marquées respectivement avec de la biotine et de la digoxygénine, révélées respectivement par FITC et Cy3, ainsi que le gène de fusion AML-1/ETO, situé sur le chromosome der(8) en position q22. Contre-coloration au DAPI.
En interphase, la proportion de noyaux analysables varie fortement en fonction de la qualité de l'expérience et représente 72% (72 noyaux sur 100) pour le cas 1342/97, dont les préparations présentaient un bruit de fond important pouvant être attribué à une sonde trop longue, et varie de 85% (169/200) à 89% (178/200) pour les autres cas dont les préparations étaient de meilleure qualité.
Par rapport au FISH métaphasique, la proportion de cellules anormales est plus faible. Cette diminution est causée par la prise en compte en interphase de lymphocytes normaux qui ne se divisent pas dans les conditions de culture utilisées in vitro. Cette diminution varie de 2% à 14% et pourrait refléter une variation dans la proportion de lymphocytes entre les différents patients.
Fig. 10: Mise en évidence de la t(8;21)(q22;q22) par FISH à deux couleurs sur un noyau interphasique, à l'aide des sondes P1 164 et CO 664 marquées respectivement avec de la biotine et de la digoxygénine, révélées respectivement par FITC et Cy3. Le gène chimérique AML-1/ETO est mis en évidence par deux signaux très rapprochés (un révélé par FITC et un par Cy3). Contre-coloration au DAPI.
III.2.3 Résultats sur les moelles de patients présentant une LMA-M2 sans t(8;21)(q22;q22).
Les sondes P1 164 et CO 664 ont été appliquées à 6 patients présentant une LMA-M2 sans t(8;21)(q22;q22) dans le but de mettre en évidence un éventuel réarrangement AML-1/ETO. Ces patients ne présentent pas de t(8;21)(q22;q22) mais sont caractérisés soit par une anomalie cytogénétique associée à la t(8;21)(q22;q22), en particulier del(9q), soit par un réarrangement impliquant 8q22, soit par des blastes avec une morphologie typique des LMA-M2. La présence d'un réarrangement AML-1/ETO a, en effet, été démontrée chez des patients atteints de LMA-M2 sans t(8;21)(q22;q22). Les analyses ont été effectuées à partir de lames de cytogénétique conventionnelle conservées à -70°C dans une boîte entourée de papier d'aluminium contenant un dessiccateur. Les préparations de seulement deux patients ont permis d'obtenir un résultat. Les quatre autres testés n'ont pas donné de résultats analysables pour plusieurs raisons: absence d'hybridation, lames illisibles à cause d'un voile bleu épais ou bruit de fond trop important. Les résultats (Tableau 7) ne représentent que les métaphases analysables. En moyenne, 10% à 15% des métaphases ont été éliminées, ceci étant principalement dû à une absence d'hybridation ou à un bruit de fond important.
Tableau 7: Proportions de métaphases présentant un ou deux signaux avec les sondes P1 164 et CO 664 sur les moelles de patients atteints d'une LMA-M2 mais ne présentant pas de t(8;21)(q22;q22).
| Sondes | P1 164 | CO 664 | ||||||||||||||
| Signaux | 2 | 1 | 2 | 1 | ||||||||||||
| Patients | Spots | 2/2 | 2/1 | 1/1 | Total | 2/0 | 1/0 | Total | 34731 | 2/2 | 2/1 | 1/1 | 2/0 | 1/0 | Total | |
| Exp. | ||||||||||||||||
| 1851/92 | F119/1 | 86(25) | a | 0 | 14(4) | 100(29) | 0 | 0 | 0 | 86(25) | 14(4) | 0 | 100(29) | 0 | 0 | 0 |
| F119/2 | 88(21) | 12(3) | 0 | 100(24) | 0 | 0 | 0 | 92(22) | 8(2) | 0 | 100(24) | 0 | 0 | 0 | ||
| Total | 87(46) | 6(3) | 7(4) | 100(53) | 0 | 0 | 0 | 89(47) | 11(6) | 0 | 100(53) | 0 | 0 | 0 | ||
| 419/96 | F119/3 | 92(23) | 8(2) | 0 | 100(25) | 0 | 0 | 0 | 92(23) | 4(1) | 4(1) | 100(25) | 0 | 0 | 0 | |
| Moyenne | 89(69) | 6(5) | 5(4) | 100(78) | 0 | 0 | 0 | 90(70) | 9(7) | 1(1) | 100(78) | 0 | 0 | 0 | ||
100% des métaphases présentent deux signaux (à un ou deux spots) sur les deux chromosomes avec les sondes P1 164 et CO 664. Par rapport aux moelles contrôles, la proportion de métaphases avec deux spots sur les deux chromosomes (2/2) est plus élevée (89% contre 86% pour P1 164 et 90% contre 86% pour CO 664), entraînant une diminution dans la proportion de métaphases avec deux spots sur un chromosome et un seul sur l'autre (2/1) (7% contre 10% pour P1 164 et 9% contre 11% pour CO 664). Le nombre de métaphases n'est cependant pas assez élevé pour déterminer si cette différence est significative.
Chez ces deux patients, les résultats (Tableau 8) ont montré l'absence de réarrangement des gènes AML-1 et ETO.
Tableau 8: Comparaison des résultats entre la cytogénétique conventionnelle et le FISH pour des patients atteints de LMA-M2, sans t(8;21)(q22;q22).
| Proportion de métaphases présentant une t(8;21) | ||||
| Bandes G | FISH | |||
| Patients | Caryotype | % de métaphases | ||
| présentant le gène de | ||||
| fusion | ||||
| 1851/92 | 46,XX,del(9)(q12-13q34) [4]/ | 0 | [53] | a |
| 46,XX [6] | ||||
| 419/93 | 47,XY,+4 [5] | 0 | [25] | |
| 46,XY [20] | ||||
| 1069/96 | 46,XY [25] | aucun résultat | ||
| 1834/96 | 46,XX,del(9)(q?) [1]/ | aucun résultat | ||
| 46,XX,-3,+ chr. cassé? [1]/ | ||||
| 46,XX [26] | ||||
| 1422/93 | 46,XY,del(9)(q13q34) [23] | aucun résultat | ||
| 1289/94 | 46,XY,?add8(q?22) [18] | aucun résultat | ||
| 47,idem,+? [1] | ||||
| 46,XY [6] | ||||
Les sondes à séquences multiples pBS 8 et pBS 21 permettent une bonne mise en évidence de leurs chromosomes cibles.
La sonde pBS 8 hybride intensément le centromère du chromosome 8, suggérant la présence en grand nombre de séquences centromériques hautement répétitives dans cette bibliothèque.
La sonde pBS 21 hybride la région centromérique des autres chromosomes acrocentriques. Cette hybridation est causée par la présence de séquences répétitives, autres que les séquences ribosomiales, communes à tous les chromosomes acrocentriques.
Les sondes pBS 8 et pBS 21 ont été appliquées à trois patients présentant une t(8;21)(q22;q22) (Tableau 9). Sur les 117 métaphases, 109 (93%) ont permis la mise en évidence de la translocation.
Tableau 9: Proportion de métaphases analysables par FISH à deux couleurs avec les sondes pBS 8 et pBS 21.
| Patients | Métaphases | Proportion | |
| Répertoriées | Analysables | analysable (%) | |
| 1358/97 | 20 | 17 | 95 |
| 205/96 | 44 | 41 | 93 |
| 1342/96 | 53 | 51 | 96 |
| Moyenne | 117 | 109 | 93 |
Il est important de noter que ce type de sondes ne permet pas d'étude interphasique, les signaux étant trop diffus.
Fig. 11: Mise en évidence, sur une métaphase normale, des chromosomes 8 et 21 entiers à l'aide des sondes pBS 8 et pBS 21, marquées respectivement à la digoxygénine et à la biotine et révélées respectivement par Cy3 et FITC. Contre-coloration au DAPI.
Fig. 12: Mise en évidence, sur des métaphases présentant la t(8;21)(q22;q22), des chromosomes 8 et 21 entiers à l'aide des sondes pBS 8 et pBS 21, marquées respectivement à la digoxygénine et à la biotine et révélées respectivement par Cy3 et FITC. Contre-coloration au DAPI.
Les concentrations des sondes et de COT-1 DNA humain déterminées lors de nos expériences sont différentes de celles reportées dans la littérature (Sacchi et al., 1995). Sacchi suggère d'utiliser la sonde P1 164 à une concentration de 40 ng/µl et la sonde CO 664 à une concentration de 4 ng/µl. La précipitation devrait se faire avec du COT-1 DNA à 23x. Dans notre mise au point, nous utilisons une concentration de P1 164 et de CO 664 à 10 ng/µl. La précipitation se fait avec du COT-1 DNA à 50x. Cette différence pourrait être due aux conditions de travail qui sont différentes entre les deux laboratoires.
D’une manière générale les résultats obtenus permettent une bonne analyse en métaphase. En effet, pour les moelles de patients ayant la t(8;21)(q22;q22), il n'y a qu'un faible pourcentage de métaphases non analysables (entre 14% et 22%). Ces proportions sont comparables à celles décrites dans la littérature, Sacchi ayant obtenu, dans son étude, entre 15% et 20% de métaphases ininterprétables. Néanmoins, ces résultats dépendent de plusieurs paramètres (cf. chapitre III.1), dont un des plus importants serait la longueur de la sonde. Si la sonde est trop longue de quelques centaines de paires de bases, il peut y avoir un bruit de fond relativement important et les signaux seront difficilement analysables. A l'opposé, une sonde trop courte pourrait donner des signaux très faibles, à peine visibles au microscope. L’incubation avec la DNase est un moment important pour le résultat final, et il est donc important de pouvoir obtenir des sondes de tailles identiques à chaque expérience.
Un résumé de l'efficacité d'hybridation des sondes P1 164 et CO 664, sur les différents types de préparation, est reporté dans le tableau 10.
Tableau 10: Synthèse de l'étude sur l'efficacité de l'hybridation des sondes P1 164 et CO 664.
| Sondes | P1 164 | CO 664 | |||||||||||||
| Signaux | 2 | 1 | 2 | 1 | |||||||||||
| spots | 2/2 | 2/1 | 1/1 | Total | 2/0 | 1/0 | Total | 34731 | 2/2 | 2/1 | 1/1 | 2/0 | 1/0 | Total | |
| Sangs contrôle | 81(163) | a | 14(29) | 3(5) | 98(197) | 1(2) | 1(1) | 2(3) | 82(164) | 16(32) | 1(2) | 99(198) | 1(2) | 0 | 1(2) |
| Moelles contrôle | 86(90) | 10(10) | 1(1) | 97(101) | 3(4) | 0 | 3(4) | 86(90) | 11(12) | 1(1) | 99(103) | 1(2) | 0 | 1(2) | |
| M2 avec t(8;21) | 79(170) | 15(33) | 1(3) | 95(206) | 5(10) | 0 | 5(10) | 83(179) | 15(33) | 0 | 98(212) | 2(4) | 0 | 2(4) | |
| M2 sans t(8;21) | 89(69) | 6(5) | 5(4) | 100(78) | 0 | 0 | 0 | 90(70) | 9(7) | 1(1) | 100(78) | 0 | 0 | 0 | |
| Moyenne | 82(492) | 12(77) | 2(13) | 97(582) | 3(16) | 0(1) | 3(17) | 84(503) | 14(84) | 1(4) | 99(591) | 1(8) | 0 | 1(8) | |
Pour les contrôles (que ce soit la moelle ou le sang), nous avons utilisé des suspensions datant de quelques semaines. On peut voir une légère augmentation de la proportion de deux spots sur les deux chromosomes cibles pour les échantillons de moelle par rapport à ceux de sang.
Pour les moelles présentant la t(8;21)(q22;q22), une nette diminution dans la proportion de deux spots sur les deux chromosomes cibles (de 86% à 79% pour P1 164 et de 88% à 83% pour CO 664) est observée. Cette différence pourrait être attribuée au fait que les suspensions ont été stockées plusieurs mois au congélateur avant d'être mises sur lame.
L'efficacité de l'hybridation sur les cellules de patients atteints d'une LMA-M2 mais ne présentant pas de t(8;21)(q22;q22) est difficile à juger. En-effet, sur les douze lames (6 patients) décongelées qui ont été utilisées pour des expériences, seules trois (2 patients) (33%) ont pu être analysées (cf. chapitre III.2.3). Mais la proportion de deux spots sur les deux chromosomes cibles est très élevée pour ces deux cas (88% pour P1 164 et 90% pour CO 664). Les analyses ont été effectuées sur du matériel mis sur lame puis congelé depuis un et cinq ans, alors que les autres analyses l'ont été sur du matériel datant de cette année ou de l'année passée. On aurait pu en effet penser que le fait d'utiliser des lames décongelées ne permettrait pas d'obtenir une aussi bonne, voire même meilleure, hybridation qu'avec du matériel récemment mis sur lame. Il aurait été intéressant que les autres cas aient été analysables pour voir si ce phénomène était significatif à ce type de préparation ou si il était simplement due aux patients observés.
En moyenne, la sonde CO 664 hybride mieux ses chromosomes cibles que la sonde P1 164. Comme on peut le voir dans le tableau 10, la moyenne des spots 2/2 est plus élevée pour CO 664 que pour P1 164 (84% contre 82%). De plus, dans tous les cas, la moyenne des proportions de deux signaux est supérieure pour CO 664, donc il y a plus souvent hybridation des deux chromosomes cibles avec CO 664 qu'avec P1 164:
Le nombre de métaphases analysées n'est cependant pas suffisant pour que les différences reportées ci-dessus soient significatives, que ce soit entre les préparations ou entre les types de sondes.
Les sondes P1 164 et CO 664 ne permettent pas de révéler le chromosome der(21). Il serait intéressant de pouvoir le révéler pour améliorer le suivi de patients en rémission, en augmentant le pourcentage de cellules analysables. Dans ce sens, une méthode utilisant une combinaison d’un autre type de sondes au niveau des chromosomes 8 et 21 a été développée (G. A. Paskulin et al., 1997). Il s’agit d’utiliser deux sondes de types YAC (Yeast Artificial Chromosome) situées de part et d’autre du point de cassure du chromosome 8, ainsi qu’une sonde YAC associée à une sonde cosmide, les deux situées de part et d’autre du point de cassure du chromosome 21. Lors de l’analyse de métaphases présentant la t(8;21), le premier système de YACs va hybrider les chromosomes 8, der(8) et der(21), alors que le second système hybridera les chromosomes 21 et der(21) par le YAC et les chromosomes 21 et der(8) par le cosmide.
Nous avons pu également démontrer l'efficacité des sondes P1 164 et CO 664 en interphase par FISH deux couleurs. Toutefois une analyse interphasique demande des lames avec très peu de bruit de fond. En effet, sur les lames sans bruit de fond, 85 à 90% des interphases étaient analysables, alors que, sur la lame avec un bruit de fond soutenu et de l'hybridation non spécifique, seulement 65% (moelle contrôle) et 72% (moelle avec t(8;21)(q22;q22)) étaient analysables. En effet, en cas d'hybridation non spécifique et d'une fluorescence de faible intensité, les signaux sont difficilement identifiables et ne pourront être distingués de l'hybridation non spécifique.
Pour le suivi des patients, l'analyse en interphase peut être très utile en particulier si les cellules du patient se divisent mal. Il est cependant nécessaire de déterminer les seuils de détection dans le but de déterminer la proportion de noyaux positifs dans des cas contrôles. De plus, il est important de tenir compte du fait de la prise en compte de lymphocytes, dans l'analyse interphasique, qui peuvent diminuer les proportions de cellules anormales par rapport à l'analyse métaphasique.
Finalement, la t(8;21)(q22;q22) peut également être mise en évidence par les sondes à séquences multiples pBS 8 et pBS 21. Cette technique permet une bonne détection de la t(8;21) en métaphase, mais n'est pas spécifique d'une région particulière de ces chromosomes. Pour ce qui est de l’interphase, la détection de la t(8;21) nous semble ne pas être possible par le FISH à deux couleurs avec ce type de sondes.
Le gène chimérique AML-1/ETO a été mis en évidence par FISH à deux couleurs avec les sondes à séquence unique P1 164 et CO 664, ainsi qu'avec les sondes à séquences multiples pBS 8 et pBS 21.
Bien que la t(8;21)(q22;q22) soit facilement détectable en cytogénétique conventionnelle par la coloration en bandes G, les techniques FISH développées offrent les avantages suivants:
Toutefois, les techniques FISH ne permettent pas de remplacer les techniques de cytogénétique conventionnelle. En-effet, elles ne permettent de détecter que des anomalies précises et recherchées, mais ne peuvent pas détecter d'éventuelles anomalies additionnelles pouvant être importantes pour le pronostic. Par contre, une fois ces anomalies spécifiques connues, ces techniques représentent de grands avantages, lors de suivis et de détections de maladies résiduelles.
Sources: les définitions suivantes sont tirées de: